分享一篇发表在JACS上的文章，标题为“Live-Cell Monitoring and Omics Analysis of Liquid–Solid Transitions of Biomolecular Condensates”，通讯作者为分别来自日本九州大学、东京大学、大阪大学、京都大学的Yuichiro Hori, Takeaki Ozawa, Kazuya Kikuchi和Motonari Uesugi，研究兴趣为荧光探针与活细胞成像技术开发。
生物凝聚物是由液液相分离过程形成的无膜细胞器，发挥着重要的生理功能。然而，在一些条件下，这些凝聚物会随时间由液态转变为固态，这一现象与多种疾病密切相关，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）等。然而，传统的生物凝聚物成像方法，如融合荧光蛋白，无法区分液态与固态的凝聚物；而可以区分液固状态的光漂白后荧光恢复（FRAP）技术耗时长，通量低，不适用于大规模筛选。
因此，作者利用光活性黄色蛋白（PYP）及其特异性荧光共价配体对活细胞中凝聚物的液固状态进行成像。PYP是一种体积较小的细菌蛋白，可与4-羟基肉桂酸和多种非天然荧光配体通过共价反应结合。作者发现，固态凝聚物阻碍了凝聚物中的PYP蛋白与其共价配体的反应，因此PYP可用于分辨凝聚物的液固相状态。作者将FUS（P525L）（一种病理相关的凝聚物蛋白突变体）的PYP融合蛋白转染至HEK293T细胞中，首先添加PCAF-orange标记含有PYP的凝聚物，随后孵育48小时诱导凝聚物向固态转变，再添加PCAF-far-red进行标记。在此模式下，新形成的凝聚物仅被远红荧光标记，始终保持液态的凝聚物会被两种荧光分子标记，而由液态转变为固态的凝聚物仅被橙色荧光标记。
作者发现，双标记的凝聚物经过孵育可以融合为更大液滴，但它们无法与仅橙色标记的凝聚物融合，证明前者为液态而后者为固态。作者还使用FRAP技术证明了远红荧光与橙色荧光比率较低时，光漂白的回收率也较低，进一步证明低远红荧光标记的凝聚物为固态。
作者开发的方法还与荧光激活细胞分选（FACS）兼容，在两种荧光分子标记后，作者可通过orange/far-red荧光比例量化固化程度。通过转染12种相分离蛋白的PYP融合蛋白并进行流式评估，作者发现TDP-43及其A315T突变体最易导致固化。
最后，作者对分选得到的细胞群进行了蛋白质组分析和转录组分析，发现凝聚物固化的细胞中细胞外基质蛋白（如COL1A2、LAMC1）显著上调，说明固态凝聚物形成与细胞外基质硬化之间可能存在以前未被认识到的联系。
总之，作者利用光活性黄蛋白及其特异性荧光共价配体对活细胞中蛋白质凝聚物的液-固态转化进行成像，并进行了组学分析。
本文作者：ZCL
责任编辑：LZ
DOI：10.1021/jacs.5c07340
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c07340
