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图1. a)DNA识别以及模块化衔接子与用底物修饰的目标DNA的交联反应。b) 模块化衔接子的DNA序列选择性反应。
由识别作用驱动的化学反应是生物体内大分子实现高效高特异性反应的常用手段。这类反应常通过生物大分子对目标反应物的识别和结合作用在反应基团之间形成邻近效应，从而利用这种邻近效应加强化学反应的速率，常见于酶的催化反应和药物分子的设计等。为了将这类反应利用于DNA和蛋白质的选择性结合反应，日本京都大学Takashi Morii课题组设计了能够和目标融合蛋白及目标DNA反应的结构单元，称为模块化衔接子。模块化衔接子由DNA结合蛋白和自连接蛋白标签组成。当目标DNA上具有能够和DNA结合蛋白对应的结合序列并修饰了自连接蛋白标签的反应底物时，模块化衔接子通过其DNA结合蛋白和其对应的DNA序列的结合作用，在自连接蛋白标签和其反应底物之间产生了邻近效应，从而大大加速了模块化衔接子与目标DNA之间共价反应的反应速率 (图1a)。
图2. a) SNAP-tag与其原底物BG的交联反应与作用位点以及新设计的底物deBG与BI结构。BI用于本文中对于DNA序列选择性模块化衔接子的深入研究。b) SNAP-tag以及CLIP-tag与底物BG、BI或deBG的反应速率对比。
由于DNA结合蛋白对于其对应的DNA序列的结合作用具有特异性，所以当作者用不同的DNA结合蛋白与同一种自连接蛋白标签组成一系列不同的模块化衔接子时，这一系列结构单元会与修饰了自连接蛋白标签底物的与其对应的特异性DNA序列反应，称为具有DNA序列选择性的结合反应(图1b)。作者利用CLIP-tag时实现了DNA序列选择性，但当作者利用SNAP-tag组成一系列模块化衔接子时，由于SNAP-tag的反应速率太高，使得模块化衔接子在反应中失去了对DNA序列的选择性。这一点通过分析模块化衔接子的反应动力学并比较自连接蛋白标签的反应速率与DNA结合蛋白结合过程的参数可以得到证实。因此，通过参考SNAP-tag的蛋白晶体结构，作者重新设计了SNAP-tag的底物从而将SNAP-tag的反应活性调节到和CLIP-tag类似的程度 (图2)。通过将自连接蛋白标签的底物修饰到目标DNA上，作者实现了SNAP-tag系列的模块化衔接子在反应中的DNA序列选择性。与此同时，作者还发现新设计的SNAP-tag底物能够完美避免与CLIP-tag的副反应，在SNAP-tag与CLIP-tag之间具有了良好的化学选择性，从而使得SNAP-tag系列和CLIP-tag系列的模块化衔接子之间具有了非常出色的正交性。这启发作者利用SNAP-tag系列和CLIP-tag系列的模块化衔接子设计并得到6种具有对不同DNA序列具有序列选择性以及对自连接蛋白标签具有化学选择性的模块化衔接子。最后，利用DNA折纸纳米结构，作者在AFM下观察到两系列模块化衔接子的DNA序列选择性和化学选择性（图3）。
图3. a)具有五孔结构的二维DNA折纸纳米结构体，其中四个孔分别设计了用BI以及被BC(CLIP-tag的反应底物)修饰的蛋白结合的特异性DNA序列。b~e)DNA纳米结构体分别与四种不同的模块化衔接子的特异性组装。f）DNA纳米结构体与拥有ZF结合蛋白的模块化衔接子反应，体现DNA序列选择性。g）DNA纳米结构体与拥有SNAP-tag的模块化衔接子反应，体现化学选择性。
论文信息：
Tuning the Reactivity of a Substrate for SNAP-Tag Expands Its Application for Recognition-Driven DNA-Protein Conjugation
Zhengxiao Zhang, Prof. Eiji Nakata, Dr. Huyen Dinh, Dr. Masayuki Saimura, Prof. Arivazhagan Rajendran, Prof. Kazunari Matsuda, Prof. Takashi Morii
Chemistry – A European Journal
DOI: 10.1002/chem.202103304
