纳米孔道蛋白质单分子测序技术的关键问题之一是如何提高现有纳米孔道传感界面的空间分辨能力。近日，南京大学龙亿涛教授团队与北京大学陈鹏教授团队通过长期的共同合作与探索，将基于吡咯赖氨酸的遗传密码子扩展技术应用于Aerolysin纳米孔道界面。经过4年的摸索及体系优化，实现将非天然氨基酸高效地引入了纳米孔道的传感区域内，从而设计调控了灵敏域内每一个氨基酸的空间取向，获得了三维化学及物理环境可控的蛋白质孔道界面，有效提高了纳米孔道对单个多肽分子的空间分辨能力（图1）。

双方团队通过筛选高效的氨酰tRNA合成酶和优化Aerolysin蛋白的表达条件，将非天然氨基酸掺入的成孔蛋白产量提高至5 mg/L（图2）。大量重复实验得到开孔电流的标准差与野生型相当，证明了遗传密码子扩展技术的高产物均一性。

通过分子动力学模拟和单通道实验分析了非天然氨基酸构建的传感区域。相较于天然氨基酸在孔道内的贴壁行为，较长的芳香性氨基酸侧链在孔道内呈现有利于多肽检测的立体几何构象，形成一个芳香性多肽传感灵敏域。芳香性纳米孔道将多肽的阻断时间延长了十倍，实现了对混合样品中不同长度的多肽分子的完全区分（图3）。

该方法突破了传统纳米孔道修饰方法的局限性，建立了非天然氨基酸编码的成孔蛋白高表达体系，为用于多肽测序的超灵敏纳米孔道的理性设计开辟了新道路。