二硫键栓系绘制转录组范围内的小分子结合位点

分享一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章：Disulfide Tethering to Map Small Molecule Binding Sites Transcriptome-wide，通讯作者是耶鲁大学医学院的Matthew D. Simon教授，他的课题组主要是通过研究染色质和 RNA 来了解表观遗传记忆和调节基因表达的分子机制。在这篇文章中，作者开发了一种基于二硫键栓系在转录组水平检测RNA-小分子相互作用的策略。

在转录组水平捕获小分子与RNA相互作用的技术可以实现对可能作为治疗靶点的RNA的全局性分析。但目前依赖于不可逆化学反应的鉴定弱结合相互作用的方法可能会捕获反应性最强的位点，而非亲和力最高的位点。因此，作者关注到用于研究蛋白质-小分子相互作用和靶向特定RNA的二硫键捕获策略，将其拓展到转录组水平，开发了一种基于二硫键栓系的Tether-seq方法，用于识别整个转录组中的小分子结合位点。

这一方法首先用4-硫代尿苷（s4U）在转录组中引入可栓系位点，随后用这些s4U标记的RNA筛选含有二硫键的小分子，在适当的巯基竞争分子存在下，对RNA缺乏亲和力的分子会被竞争释放，只有具有稳定相互作用的小分子可以保留二硫键。然后将未反应的s4U位点封闭，并还原断开小分子形成的二硫键，得到游离的s4U利用MTSEA-XX-Biotin富集后，利用TimeLapse技术将其转化为C，从而通过RNA测序实现对小分子结合位点的识别。

作者首先对设计的流程进行了测试和优化，确定了s4U和2-吡啶硫醇（2PT）可以作为竞争分子去除弱结合的二硫键，而间氯过氧苯甲酸（mCPBA）可以作为温和的氧化剂将s4U转化为U，从而封闭未反应的s4U位点。

在确定流程可行之后，作者基于RNA靶向药物Risdiplam设计了几种衍生分子，用于进行Tether-seq实验。通过将测序结果中小分子处理后突变率明显增加的位点识别为潜在的RNA结合位点，作者一共鉴定到142个潜在的结合位点，并关注到其中可能性最高的细胞色素C氧化酶I（COX1）的nt 6043位点。最后作者也对小分子与COX1的结合以及COX1 nt 6043附近的二级结构进行了验证，证明了Tether-seq筛选得到的相互作用位点的能力。

总的来说，作者开发了一种基于二硫键栓系的可逆化学策略，用于在转录组中鉴定小分子-RNA相互作用位点。

本文作者：LCX

责任编辑：ZJ

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.4c00538

文章引用：10.1021/acschembio.4c00538

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