长蛋白链的多通道单分子纳米孔读取

分享一篇发表在Nature上的文章：Multi-pass, single-molecule nanopore reading of long protein strands，通讯作者是华盛顿大学的Jeff Nivala教授，他的课题组主要关注纳米孔传感、单分子蛋白质测序、CRISPR-Cas等领域。在这篇文章中，作者开发了一种基于纳米孔传感器对完整蛋白质链进行长距离、单分子读取的方法。

纳米孔技术依赖于绝缘膜上的纳米级小孔，这些小孔将两个电解质池分开，通过施加在膜上的电压驱动离子电流通过纳米孔，不同的单分子通过纳米孔可以产生不同的信号变化，从而实现对分析物分子性质的检测。这一技术有潜力实现目前Edman降解和质谱分析等策略无法实现的对复杂样品中全长蛋白质的测序。然而这一应用一直受限于难以驱动长蛋白质链通过纳米孔传感器。因此作者在此提出了一种使长蛋白质链可逆穿过纳米孔的策略。

基于此前的工作，作者提出了一个两步策略实现基于去折叠酶的纳米孔蛋白质读取。首先通过电压驱动使蛋白质从Cis到Trans穿过纳米孔，随后将ClpX去折叠酶加入Cis溶液中，通过酶介导的易位将蛋白质从纳米孔中从Trans拉出到Cis，在这一过程中实现对蛋白质的读取。

为了测试这一方法能否实现单氨基酸的分辨，作者设计了“通过优化区域进行氨基酸测序的蛋白质”（PASTOR），并确定了在PASTOR可变区域（VR）中，20种氨基酸可以产生不同的离子电流信号变化。随后也利用机器学习模型实现了对不同氨基酸对应VR信号的高准确率的识别。

然后，作者希望进一步开发一种重复读取单个蛋白质分子的方法，从而提高单分子测序方法的准确性。此前的研究表明，ClpX难以夹持多脯氨酸等特定多肽序列。因此，在PASTOR的N端掺入一个“滑”的多脯氨酸序列会诱导ClpX暂时失去对蛋白质链的控制，之后蛋白质可以通过电泳重新穿入孔中，接着ClpX重新获得对蛋白质链的控制，就可以恢复酶介导的易位，重新对蛋白质链进行读取。这种单分子重读的策略可以大幅度提高氨基酸识别的准确率。

最后，作者也尝试了基于这一方法对蛋白质条形码进行识别，对磷酸化修饰进行识别，以及对蛋白质折叠结构域进行读取。

总的来说，这篇文章中作者开发了一种使用纳米孔和去折叠酶蛋白对长蛋白质链进行重复单分子读取的方法。

本文作者：LCX

责任编辑：LYC

文章引用：10.1038/s41586-024-07935-7

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07935-7

Nature | 长蛋白链的多通道单分子纳米孔读取

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