分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition的文章，文章的标题为“Engineered Thermostable Chemically Responsive GlowCas9 System for Real-Time Therapeutic Monitoring Applications”，本文的通讯作者为 Basudeb Maji。

传统CRISPR/Cas9技术的脱靶效应与Cas9在细胞中暴露时间密切相关，因此需要一种可实时监测其在细胞内分布与活性的手段。现有的抗体或荧光检测方法灵敏度有限，且不适用于活体体系。为此，作者通过蛋白工程构建了一个兼具高稳定性与实时可检测特性的发光型 Cas9 系统——GlowCas9。

研究团队选择利用一种来自 Oplophorus gracilirostris 虾的纳米荧光素酶（NanoLuc）系统，该系统由两个亚基 LgBiT 和 HiBiT 组成，在接近时能高亲和性结合并恢复发光功能。作者将这两个亚基分别连接到Cas9蛋白的N端和C端，使其在分子内部闭合重组，形成一个可自发光的GlowCas9融合蛋白，从而赋予Cas9实时报告的功能。

在结构验证中，研究者通过重组质粒表达和Western Blot检测发现GlowCas9的分子量增加，证明融合成功。仅在GlowCas9转染细胞中观察到显著的发光信号，说明荧光素酶亚基在细胞中能正确折叠并恢复活性。非变性凝胶电泳实验显示仅有单一条带，排除了线性寡聚化的可能，证实该系统以单体闭环形式存在。细胞发光成像进一步显示GlowCas9在添加底物NanoGlo后产生强烈信号，而对细胞活性无明显影响，表明该系统兼具功能性与生物相容性。

随后，作者从结构与功能两方面系统评估了GlowCas9的性能。通过细胞热位移实验（CETSA）测得其熔解温度（Tm）明显高于野生型Cas9，体现出优异的热稳定性。在基因编辑实验中，GlowCas9与自切割GFP报告系统共转染后，可抑制GFP信号约 75%以上，略高于WTCas9的70%，显示其保持甚至增强了核酸切割活性。利用AlphaFold3进行的结构预测表明，GlowCas9与sgRNA和DNA的结合方式与WTCas9 高度一致。荧光偏振实验也证实GlowCas9–sgRNA–DNA复合体能够正确组装，这说明发光结构域的引入并未破坏Cas9的天然活性中心。

接下来，作者发现GlowCas9 展示了显著优于 WTCas9 的精确敲入能力。作者在GAPDH 基因C端设计了靶位点，并提供包含HiBiT序列的单链寡核苷酸（ssODN）作为修复模板。由于GlowCas9自身带有发光结构，研究者改进了检测方法，将发光信号与非变性凝胶电泳结合，在分离后的凝胶上加入LgBiT与NanoGlo底物，从而检测成功整合HiBiT标签的GAPDH蛋白。结果显示，GlowCas9介导的HDR信号强度显著高于WTCas9组，其模板依赖性修复效率提升约1.5倍。进一步在EMX1基因位点的敲入实验中，高通量测序结果同样表明 GlowCas9不仅总体HDR效率更高，而且HDR与NHEJ的比值也明显上升，说明其在修复途径选择上更倾向于精确的模板重组。

最后，作者将GlowCas9的发光特性用于跨系统的蛋白追踪实验。在植物叶片注射实验中，作者成功在 Solanum tuberosum 叶片中实现GlowCas9的原位检测，仅注射区域在底物存在下显示强烈发光，证明该系统可用于跨物种、跨体系的Cas9递送监控。

总的来说，本文开发了一种高兼容性的实时检测Cas9的系统GlowCas9。

本文作者：CJJ

责任编辑：TZS

DOI：10.1002/anie.202511707

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202511707