通过深度突变扫描研究蛋白-蛋白相互作用

今天给大家分享一篇最近发表在JACS上的研究，题为：Climbing Up and Down Binding Landscapes through Deep Mutational Scanning of Three Homologous Protein−Protein Complexes，文章的通讯作者是希伯来大学的Julia M. Shifman教授与本古里安大学的Niv Papo教授。

图1. 本文的研究对象

两个或多个蛋白之间的相互作用（protein−protein interactions, PPIs）在许多细胞活动（如信号转导、转录、翻译）中至关重要，而蛋白突变经常导致结合自由能的变化(ΔΔG_bind)，可能会减弱相互作用，亦可能使相互作用更加稳定。导致ΔΔG_bind 急剧变化的突变可能会重塑PPI网络，经常导致信号通路的异常与疾病的发生。因此，了解突变如何影响蛋白之间的结合对于基础生物学和生物医学科学都有重要意义。然而目前，人们仅针对少数相互作用的蛋白绘制了全面的结合图谱，而对于大多数PPI，只是通过丙氨酸突变研究了几个位点的突变对于ΔΔG_bind的影响。通过对现有等数据进行研究，作者推测突变对于不同蛋白相互作用可能有不同的影响。为了对这一问题进行探索，在本文中作者通过深度突变扫描（Deep Mutational Scanning）对牛胰蛋白酶抑制剂（bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）与不同底物间的相互作用进行了研究（图1）。

图2. （A）酵母表面展示技术的构造，（B）BPTI的突变位点，（C）通过流式细胞术测量亲和力。

作者研究了BPTI与三种结构相似蛋白对结合图谱（图1），分别是牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI) 与其共同进化的天然底物牛胰蛋白酶（BT，K_D = 10^-14 M），非同源胰的牛α-糜蛋白酶（ChT，K_D = 10^-8 M）和人类胰蛋白酶（MT，K_D = 10^-5 M），这些蛋白和BPTI的解离常数跨越了9 个数量级（图 1）。他们选取了BPTI上与胰蛋白酶相互作用的12个位点（图2B），依次将其单点突变为20种天然氨基酸，并进一步进行两点突变（由于部分数据质量不高，两点突变只收集到了约50%的数据），通过此前发展的酵母表面展示等技术，对突变后的ΔΔG_bind进行了测定。结果显示，单点突变（图3）极易影响BT/BPTI的结合，平均ΔΔG_bind约4.5 kcal/mol，几乎所有的突变均会降低二者之间的结合效果，对ChT/BPTI的影响次之，对MT/BPTI影响则最低，部分位点的突变还可以增强结合效果。多数两点突变会进一步降低BT/BPTI，ChT/BPTI的结合，而对于原本结合力就较低的MT/BPTI，两点突变产生的平均ΔΔG_bind略低于单点突变，意味着其中的许多突变组合可能进一步稳定二者的结合能力。

图3. 单点突变对ΔΔG_bind的影响

作者对于数据进行了细致地分析与讨论，着重探讨了结合力差异对于功能的影响，突变之间的关系以及突变位点产生效果的比较。BT/BPTI在长期共进化过程中，体系达到了接近最优的状态（图4），突变往往会对其结合产生剧烈的负面影响，而ChT、MT与BPTI的结合并为经过进化的优化，其结合只是由于空间结构的相互匹配，因此突变对可能会产生负面或者正面的结果，为定向进化等技术提供了可能。