新冠病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新冠肺炎严重影响人类健康和全球社会经济发展。因此，开展防治新冠状病毒感染相关的基础研究和新药研发具有重要的科学意义和应用价值。病毒蛋白酶是抗病毒药物研发的理想靶标，新冠病毒3C样蛋白酶（3CL^pro或M^pro）的抑制剂——奈玛特韦（Nirmatrelvir）已获批用于新冠肺炎的治疗。木瓜样蛋白酶（PL^pro）在冠状病毒复制和对抗宿主天然免疫反应中发挥重要作用，是抗冠状病毒药物研发的潜在新靶点。然而，为了特异性识别水解底物中的GG序列，PL^pro底物结合口袋中催化残基C111附近的空间狭长且相对封闭，难以被抑制剂占据，导致针对催化位点的抑制剂（即正构抑制剂）尤其是共价抑制剂的设计难度大而进展缓慢。目前已报道的PL^pro抑制剂抑制结构类型单一且活性较弱，尚未有任何抑制剂进入临床研究。针对这一现状，别构抑制剂的设计与发现为该靶点的新药研发提供重要选项。

近日，中国科学院上海药物研究所许叶春研究员课题组和上海高等研究院上海光源科学中心的李敏军博士合作，从筛选得到的SARS-CoV-2 PL^pro激动剂出发，通过对激动剂的作用机制研究，首次发现270位半胱氨酸残基（C270）是别构调节该水解酶活性的重要位点，并进一步鉴定了共价作用于该位点的内源性激动剂和设计了靶向该位点的首个共价别构抑制剂。

研究人员在针对老药和临床在研候选药物开展SARS-CoV-2 PL^pro的抑制剂筛选中，意外发现地美司钠（Dimesna）和吡硫醇（Pyritinol）两个老药对SARS-CoV-2 PL^pro具有明显的激动作用。考虑到两个激动剂中均包含二硫键，推测其可能通过共价作用于蛋白酶中的半胱氨酸而起效，通过对SARS-CoV-2 PL^pro表面四个半胱氨酸的突变而进一步识别C270是激动剂实现共价别构调控蛋白酶水解活性的作用位点。

联想到内源性物质谷胱甘肽GSSG（氧化型谷胱甘肽）也包含二硫键，研究人员测定了谷胱甘肽对SARS-CoV-2 PL^pro酶活的影响效应。不出意外，研究结果表明谷胱甘肽通过共价作用于C270而别构激活SARS-CoV-2 PL^pro。进一步研究发现，SARS-CoV-2 PL^pro在细胞内因内源性谷胱甘肽的存在而表现出更高的水解活性。由于C270只存在于SARS-CoV和SARS-CoV-2的PL^pro中，在其他冠状病毒的PL^pro中该位点并非半胱氨酸，因此推测谷胱甘肽对SARS-CoV-2 PL^pro的激活作用可能与新冠病毒高传染性和致病性相关，当然这需要更多的实验验证。

随后，研究人员对C270进行了点突变以测试不同氨基酸取代对蛋白酶水解活性的影响，发现带正电荷的氨基酸取代能够部分抑制PL^pro的酶活。受此启发，研究人员找到了同时携带二硫键和正电荷的化合物DMGA，酶活测试表明DMGA能有效抑制剂SARS-CoV-2 PL^pro水解活性，IC₅₀为9.4 µM。进一步通过多种生化实验的验证，发现DMGA确实通过共价作用于C270而别构抑制SARS-CoV-2 PL^pro酶活。

因此，研究人员以意外发现的激动剂为工具分子进行深入研究，首次发现C270作为调节SARS-CoV-2 PL^pro酶活性的共价别构位点，而DMGA作为靶向该位点的首个共价别构抑制剂验证了该位点的有效性。该研究结果为设计新型的SARS-CoV-2 PL^pro抑制剂提供了重要线索，同时也为抗病毒药物的研发提供了新思路。