分享一篇发表在ACS Central Science上的文章，标题为 “Human IgG Subclasses Differ in the Structural Elements of Their N-Glycosylation”, 文章的通讯作者是来自荷兰乌德勒支大学分析化学的Karli R. Reiding助理教授；Karli R. Reiding助理教授专注于糖蛋白质组学研究。本文主要通过开发纳米亲水相互作用色谱（HILIC）-LC-MS/MS方法揭示了四个 IgG 亚型中每个亚型的不同结构糖基化特征。
在本文中，作者开发并采用纳米HILIC-LC-MS/MS方法来分离和表征源自IgG 亚型的胰蛋白酶Fc糖肽的组成和结构变体。
图1 跨IgG亚型的IgG N-糖基化的组成和结构特征及其功能影响
免疫球蛋白G（IgG）是人血清中一些最丰富的（糖）蛋白，平均浓度为10 mg/mL，在体液免疫反应中具有关键功能。IgG抗体家族由四个亚型组成，即 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4（图 1）。已经开发了各种质谱（MS）方法来表征 IgG糖基化，包括液相色谱-质谱（LC-MS）、毛细管电泳-质谱法（CE-MS）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。因此，通过结合液相色谱领域的最新创新和MS，即高分辨率HILIC-LC和结构依赖性MS/MS，作者提出了能够在糖结构水平上定量复杂样品中IgG糖肽的分析方法。 文章方法结合了两个关键分析特性，即（1）用于高效分离糖肽组成和结构异构体的高分辨率离子HILIC-LC，以及（2）利用基于更高能量碰撞解离（HCD） 的MS/MS碎裂来精确鉴定观察到的糖肽异构体上的游离寡糖组成和拓扑。从HEK293F细胞中纯化重组IgG1（rIgG1），并用胰蛋白酶消化，然后通过nano-HILIC-LC-MS/MS进行分析。值得注意的是，使用HILIC分离，作者观察到多个 PEP1糖肽是同量异位的，即表现出相同的表观质量（见图 2）。 图2 对HEK293F细胞中产生的rIgG1的四对胰蛋白酶N-糖肽异构体进行基于 HILIC的分离和串联质谱分配
为了能够分离、分配和定量IgG1糖肽的结构异构体，作者接下来着手测试其他IgG是否显示出相似或不同的聚糖性状。为了研究 IgG 亚型和同种异型之间的糖基化差异，作者分析了来自重组IgG亚型和同种异型的胰蛋白酶糖肽HEK293F细胞。与上述rIgG1样品一样，对于其他rIgG亚型，做观察到糖肽异构体的色谱分离（图 3）。
图3 重组IgG亚型和同种异体型的比较
紧接着，作者着手分析来自20名健康供体的混合血浆样品中的IgG糖肽（图 4）。正如预期的那样，一般血浆N-糖基化谱已经与相应的重组IgG（在HEK293F细胞中产生）观察到的相当不同，血浆中的游离寡糖多样性明显降低，并且不存在LacdiNAc基序。与关于亚型丰度的文献保持一致，作者观察到非常强烈的IgG1和IgG2信号，以及IgG3和IgG4的糖肽丰度较低。
图4 在从 20 个供体的混合血浆样品中获得的 IgG 亚类中观察到的结构性 N-糖基化
血浆蛋白糖肽长期以来一直被提议作为疾病的诊断生物标志物，但这确实需要稳定的背景来进行比较。因此，作者接下来探讨了IgG结构 N-糖基化在多大程度上会因个体和时间而异。为了实现这一目标，从两名健康供体（D1，女性，66岁和D2，男性，57岁）那里获得了三个血浆样本，大约每隔一个月取样一次（图 5）。随后使用nano-HILIC-LC-MS/MS方法对这些进行了研究。 图5 在 3 个不同的采样时间点从两个个体供体获得的亚类特异性 IgG 糖基化
通过结构糖蛋白质组学比较样品，得到以下信息：1）总体而言，单个血浆样品中的组成和结构 N-糖基化特征与在混合人血浆样品中观察到的特征非常匹配。2）除了独特的亚型特征外，也观察到D1和D2之间的差异。3）相同组成中游离寡糖异构体的相对比率显示出与混合血浆中观察到的亚型特异性特征一致。4）随着时间的推移，所有亚型的组成和结构特征的相对丰度基本保持不变。必须注意的是，单个IgG分子的血浆寿命远短于3个月。这表明产生IgG的细胞（血浆细胞和B细胞）内具有很强的糖基化控制，或循环中已有的IgG糖型的有效重塑、回收和/或降解。 综上所述，作者开发并采用纳米HILIC-LC-MS/MS方法来分离和表征源自 IgG亚型的胰蛋白酶Fc糖肽的组成和结构变体，这种方法能够对不同人IgG亚型中普遍存在的IgG N-糖基化进行全面的定性和定量分析。结构糖蛋白质组学的出现将增强我们对不同生物来源中聚糖多样性的理解，从而有助于抗体疗法和疫苗制剂的开发和优化。 文章作者：LT 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.4c01157 责任编辑：WXL
