通过颗粒酶B的淬灭活性探针评估肿瘤对免疫治疗的响应

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Granzyme B-Targeting Quenched Activity-Based Probes for Assessing Tumor Response to Immunotherapy”。文章的通讯作者为美国国家癌症研究所的Euna Yoo研究员，她致力于使用化学蛋白质组学策略开发化学探针，以实现对肿瘤免疫的监测与调控。

近年来，肿瘤免疫治疗蓬勃发展，然而机体对免疫疗法的响应差异较大，缺乏一种可靠的监测方法来实时评估患者对肿瘤免疫疗法的响应。颗粒酶B（Gzm B）是肿瘤免疫疗法触发免疫效应的重要生物标志物，肿瘤微环境（TME）中的Gzm B高活性标志着CTL和NK细胞在有效浸润和激活。基于活性的探针（ABP）是靶向标记这类活性丝氨酸蛋白酶的理想工具，特别地，当与荧光报告基团偶联时，ABP可广泛用于组织内酶活性的分子成像。然而，基于上述设计的ABP是“常亮”（“always-on”）的，在活体成像中具有很高的背景荧光信号，使得感兴趣的活性信号难以被读出；相反，“可激活”（“activable”）的探针则可实现极高的信噪比，这类探针被称为淬灭ABPs（quenched ABPs）。在这类探针中，其N-端偶联的荧光基团被C-端偶联的淬灭基团所淬灭，只有当淬灭基团在活性酶的作用下而离去后，荧光基团才具有荧光信号。

本文中，作者首先优化了GzmB的底物四肽：GzmB的典型底物序列为IEPD，但该序列与另一蛋白酶Casp-8具有交叉反应性。为了避免对Casp-8的脱靶，作者大胆地将多肽的P1 Asp替换为了磺基丙氨酸（cysteic acid, Cya），结果显示，这种改动同时增强了多肽对GzmB的亲和力和选择性，Ac-IEPCya-ACC快速地被GzmB切割，而几乎不被Casps切割。随后，作者在C端引入了数种基于二苯基磷酸酯/苯基次磷酸酯的丝氨酸反应性弹头，证实了IEPCya序列可被改造成强效的ABP。

接下来，作者着手引入荧光和淬灭基团：在N端偶联Cy5，同时在苯基次磷酸酯（phenyl phosphinate）弹头的烷基链上偶联淬灭基团QSY21，合成了化合物10。根据上述机理，在游离状态下，QSY21淬灭Cy5的荧光信号，而一旦活性酶的丝氨酸残基进攻苯基次磷酸酯弹头，QSY21将离去，从而恢复Cy5点荧光信号。作者随后证实了化合物10可以灵敏地响应GzmB的活性变化，也通过凝胶内ABPP证实了这种标记的良好选择性。

最后，作者将这种淬灭探针用于活体成像。作者构建了4T1肿瘤小鼠模型，该肿瘤的免疫原性被认为较差；随后，作者对荷瘤小鼠进行免疫治疗，并成功地使用探针10表征了不同疗法下小鼠TME中GzmB活性的差异。受此鼓舞，作者使用探针10进行了免疫检查点阻断疗法下GzmB活性的实时成像，结果显示，在CT26结直肠癌的TME治疗模型中，探针表征出的GzmB活性与个体对治疗的响应吻合。总结而言，作者通过优化底物肽序列和共价弹头、引入荧光-淬灭基团对，设计了靶向GzmB的高选择性淬灭ABP，实现了对肿瘤免疫疗法响应的实时、灵敏的评估。