论文DOI：10.1021/acscatal.0c00128 本研究通过对具有反应杂泛性的CYP72A63进行理性设计，从而控制其化学选择性和区域选择性，并通过匹配适当的氧化还原伴侣使其能特异性地合成多种稀有甘草三萜。众所周知，甘草酸是一种来自甘草根部的天然产物，具有抗病毒、抗肿瘤等多种生理活性，是传统中药甘草的主要活性成分。甘草酸在甘草根中积累量较高（>2%），可以通过植物提取的方式获得。然而甘草中还存在一些含量极低但同样具有重要生理功能的稀有三萜包括甘草酸的中间产物甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛以及甘草次醇的同分异构体等。除了具有重要的生理活性外，这些稀有三萜分子骨架上的羟基、醛基等功能基团的存在为对这一类分子进行化学修饰，从而获得结构更加多样、功能更加丰富的新型衍生物提供了可能。但是由于稀有三萜在植物中极低的含量以及复杂的分子结构，导致这类化合物难以制备。 P450标志性的氧化反应是C-H的羟化反应，修饰天然产物的P450也可以对C-H进行连续氧化形成羧基。在前期的研究中，李春教授课题组利用来自于苜蓿的CYP72A63在酿酒酵母体内合成了甘草次酸，但是由于CYP72A63催化的杂泛性，其在酿酒酵母体内可同时合成甘草次酸、甘草次醇、甘草次醛以及29-OH-11-oxo-β-香树脂醇。虽然实现了稀有甘草三萜的合成，但是由于其结构相似性导致后期分离困难。要特异性获得苷草次酸、甘草次醇、甘草次醛，需要精确地控制CYP72A63反应进程，改变其化学选择性，使氧化反应停留在不同的产物上；而要实现29-OH-11-oxo-β-香树脂醇的特异性合成则需要改变其区域选择性。虽然目前可以通过重塑P450的活性口袋改变其区域选择性，但是鲜有控制P450反应进程研究的报道，而且目前对于P450的改造主要针对晶体结构已解析的蛋白如P450cam。由于植物源P450为膜蛋白，不易获得有功能的纯酶，难以进行晶体结构解析与体外的酶功能验证，因此对于膜结合P450氧化酶的研究较为困难。基于CYP72A63的杂泛性，李春教授课题组认为这是由于CYP72A63对不同的中间产物具有不同契合性的结果，要控制其反应进程就需要改变其化学选择性，即控制其对于不同中间产物的契合性，比如要促进甘草次醇的合成就需要促进初始底物11-oxo-β-香树脂醇的契合性同时降低甘草次醇的契合性以防止其进一步氧化。要控制其区域选择性，就需要控制C-29和C-30相对于血红素铁的相对位置，使非目标基团远离血红素铁。由于P450蛋白具有相似的空间架构，针对没有晶体结构及体外验证难以实现的问题，李春教授课题组基于同源建模和分子对接对CYP72A63进行了理性设计，同时利用酿酒酵母的体内验证的方式对突变体的功能进行了验证以解决体外试验难以进行的问题。由于11-oxo-β-香树脂醇的C-29与C-30与血红素铁的距离均在P450可氧化的范围之内，且C-30比C-29更加靠近血红素铁，因此CYP72A63可产生少量的29-OH-11-oxo-β-香树脂醇。由于甘草次醇对于野生型CYP72A63的契合性较差，其C-30羟基在疏水作用下被推离血红素铁，使其进一步氧化受阻，因此主要产物为甘草次醇。将11-oxo-β-香树脂醇疏水的C-29推离血红素铁，需要降低CYP72A63活性口袋近端的疏水性以增加其与底物间的斥力作用；将甘草次醇亲水的C-30羟基拉近血红素铁同样也需要降低酶活性口袋近端的疏水性以降低底物与分子间的斥力。基于此，突变体CYP72A63（T338S）实现了11-oxo-β-香树脂醇C-30的选择性氧化，同时使甘草次醇的羟基更加靠近血红素铁，提高了其契合性，促进了甘草次醇的进一步氧化从而实现了甘草次酸的特异性合成。▲图1. A）CYP72A63（T338S）与11-oxo-β-香树脂醇的结构模型，B) CYP72A63（T338S）与1甘草次醇的结构模型，C) CYP72A63（T338S）氧化11-oxo-β-香树脂醇的产物
对于野生型CYP72A63而言，其活性口袋近端对于11-oxo-β-香树脂醇的契合性要显著优于甘草次醇，要阻止甘草次醇的氧化需要进一步降低甘草次醇的契合性。酶活性口袋远端底物通道入口的性质对于底物的识别与结合具有重要影响，为能够在降低甘草次醇的契合性的同时尽量保持11-oxo-β-香树脂醇的契合性，本研究在保留CYP72A63活性口袋近端不变的情况下，提高了活性口袋远端的疏水性。鉴于此，获得突变体CYP72A63（L509I）阻止了甘草次醇的进一步氧化，实现了甘草次醇的特异性合成。▲图2 突变体CYP72A63（L509I）氧化11-oxo-β香树脂醇的产物图谱
特异性合成甘草次醛需要P450具有在醇和醛中间产物间的精确的化学选择性，由于甘草次醇和甘草次醛在疏水性上的相似性，本研究通过对CYP72A63进行改造并未获得理想的突变体。由于P450的活性受到其还原伴侣的影响，P450与CPR之间的相互作用不但会影响P450的活性还可能改变P450的构象从而影响其反应特性。李春教授课题组在前期研究中发现，一些被认为低效的还原伴侣蛋白与CYP72A63进行匹配时会显著降低甘草次酸的产量而大量积累甘草次醇。本研究中，李春教授课题组通过将突变体CYP7A63（T338S）与一部分低效还原伴侣匹配，成功抑制了甘草次醛的进一步氧化，从而实现甘草次醛的特异性合成。▲图3 突变体CYP72A63（T338S）与GuCPR2匹配时氧化11-oxo-β-香树脂醇的产物谱
4. 29-OH-11-oxo-β-香树脂醇的特异性合成通过对11-oxo-β-香树脂醇与CYP72A63的对接模型分析发现，位于底物E-环两侧的L149与L398残基对底物有一定的支撑作用，这两个位点氨基酸侧链的改变有可能会改变底物C-29与C-30相对于血红素铁的位置。基于此，本研究对这两个位点分别进行了饱和突变，获得突变体CYP72A63（L398I）使底物在活性中心中发生近180°的旋转，反转了C-30与C-29的相对位置，使C-30远离血红素铁，实现了29-OH-11-oxo-β-香树脂醇的特异性合成▲图 4 A）11-oxo-β-香树脂醇与野生型CYP72A63的对接模型，B) 11-oxo-β-香树脂醇与CYP72A63（L398I）的对接模型，C) CYP72A63（L398I）氧化11-oxo-β-香树脂醇的产物谱
在P450催化的氧化反应中，P450获得电子和质子的效率影响着P450的氧化活性。由于提高了其质子传递效率，与野生型CYP72A63相比，突变体CYP72A63（T338S）氧化11-oxo-β-香树脂醇产生的氧化产物总量提高了2.2倍。为进一步提高质子传递效率，本研究对质子传递途径周围的氨基酸进行分析，发现W205的大体积侧链限制了K236的构象变化从而对质子传递有一定的限制作用。通过将其突变为低位阻的氨基酸，突变W205A解除了对质子传递途径的限制，进一步提高了突变体的活性，促进了甘草次醇，甘草次醛和甘草次酸的合成。本研究通过基于同源建模与分子对接分析的理性设计，重塑了杂泛性的CYP72A63的催化特性。通过定点突变，利用一个杂泛性的酶构建了一系列具有特定功能的突变体，并利用其实现稀有甘草三萜的特异性合成。本研究提供了一种通过控制不同中间产物与P450契合性以及匹配氧化还原伴侣的策略来控制P450反应特性，该策略为精确控制P450催化的氧化反应进程，实现稀有天然产物尤其是一些难以积累的中间产物的合成提供了借鉴。同时，利用酵母体内验证的方式对突变体进行验证，为难以纯化的植物P450的验证提供了一种可行的方法。
