介绍一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Unveiling the Accurate Site-Specific N- and O- Glycosylation of Hyperglycosylated Erythropoietin Drugs by an Integrated Approach[1]，文章的通讯作者是上海交通大学药学院的Jianwei Zhu和Juan Wei。
糖基化是最常见的翻译后修饰（PTM） 之一，在调节蛋白质结构和稳定性方面起着关键作用，同时介导信号转导、抗原识别和免疫反应等基本过程。糖基化位点和糖型都会对药物疗效和安全性产生深远影响。高度糖基化是开发长效高效生物治疗药物的一种策略，它通过增加糖基化位点和/或糖基含量，从而调节吸收、分布、代谢和排泄 （ADME） 过程。高度糖基化蛋白因其复杂的糖链结构和异质性，给传统分析方法带来了挑战，尤其是在全面解析所有糖基化位点的糖链信息方面存在困难。
重组人EPO是首个获批的糖蛋白药物，用于治疗慢性肾病和癌症相关贫血。然而，其半衰期较短，需要频繁给药。通过糖基化工程改造，第二代EPO药物达依泊汀α（darbepoetin alfa）增加了两个N-糖基化位点，显著延长了半衰期。尽管对rhEPO的糖基化位点进行了广泛研究，但对第二代高度糖基化EPO（hyperEPO）的糖基化分析仍有限，主要由于其糖基化位点间距较近且糖链复杂，导致其位点特异性糖基化分析尚未深入探索。
研究者开发了一种集成工作流程（图1），结合了全面的游离寡糖分析和详细的糖肽水平研究。首先，构建了一个高精度、实验交叉验证的游离寡糖数据库。为了最大限度地暴露所有糖基化位点，研究者优化了非特异性酶消化方案，减少了具有多个糖基化位点的肽的产生，还有助于使用 HILIC SPE 小柱富集O-糖肽。并且研究者采用一管双衍生化策略（先二甲基化后酰胺化），稳定唾液酸并提高其检测效率。
图 1.高度糖基化蛋白位点特异性糖基化分析的工作流程示意图。
通过两种互补的糖链衍生化方法，研究者构建了一个高准确性的糖链数据库，涵盖了darbepoetin alfa和EPO-XL的N-和O-糖链。以及应用β 消除法从两个样品中释放O-糖，从而能够构建O-糖数据库。两者的糖谱存在不同之处，darbepoetin alfa的有着相对较小的N糖结构和更高的O-乙酰化水平。
图 2.唾液酸衍生的N-糖分别从 （a） darbepoetin alfa 和 （b） EPO-XL 释放的 MALDI-TOF MS 谱图。
EPO-XL 和 darbepoetin alfa 有相同的氨基酸序列，每个序列都含有 5 个潜在的N-糖基化位点和一个特征性的O-糖基化位点 Ser126。五个 N-糖基化位点非常接近。此外，这些位点缺乏常用特异性蛋白酶的切割位点。常规蛋白酶的模拟酶切未能产生每个糖肽仅包含一个糖基化位点，同时覆盖所有五个 N-糖基化位点的糖肽。通过对非特异性蛋白酶的研究，发现蛋白酶K在优化条件下（酶/样品比例1:1，37°C，48小时）能有效产生单个糖基化位点的肽段，覆盖所有潜在的N-和O-糖基化位点。（表1）
表1.HyperEPO 蛋白通过计算机模拟或实验酶消化生成的肽
为了提高唾液酸的稳定性并提高唾液酸化肽的电离效率，研究者采用了一种简化的糖肽衍生化策略，该策略包括两个连续的步骤：二甲基化和酰胺化。优化后的方法，可确保伯胺和羧基得到适当修饰，从而提高糖肽稳定性和检测灵敏度，特别是对于唾液酸化肽。应用于 EPO-XL，以比较在未衍生化和衍生化糖肽中观察到的糖型，如图3所示，衍生化后检测到的唾液酸个数明显增加。
图 3.无衍生化（左）和有衍生化（右）的N-和 O-糖肽的比较分析。
研究者采用了两种互补串联质谱技术：阶跃碰撞能量 HCD （sceHCD） 和带 HCD 补充活化的电子转移解离 （EThcD）。除了先前报道的 EPO 蛋白中 Ser126 位点O-糖基化位点外，还在 EPO-XL 的 Ser120 位点明确地鉴定了一个新位点。在 EPO-XL 中一致检测到O-糖基化 AISPPDAA（残基 118-125）糖肽。在衍生的 AIS（HexNAcHexNeuAc）PPDAA 肽的 sceHCD 和 EThcD MS/MS 谱图中，观察到丰富的碎片离子。（图4）
图 4.通过衍生糖肽 AIS（HexNAcHexNeuAc）PPDAA 的 （a） sceHCD 和 （b） EThcD MS/MS 分析鉴定 EPO-XL 蛋白中 Ser120 位点的新O-糖基化位点。
研究者在市售药物达贝泊汀α 注射液和更高效的新型类似物 EPO-XL 之间进行了详细的位点特异性N-和O-糖基化比较，如下所示图5。两者中一致观察到四分支糖链，每种蛋白内的糖型分布相似。然而，在两者之间观察到不同的糖基化组成。EPO-XL 富含 H8N7F1SX、 H9N8F1SX和 H10N9F1SX，而 darbepoetin alfa 表现出更高丰度的H7N6F1SX。EPO-XL 显示出更均匀的糖型分布，在所有五个位点中主要具有高丰度的 LacNAc 四分支结构。相比之下，darbepoetin alfa 在双、三和四分支聚糖方面表现出更大的结构多样性。
图 5.衍生化 darbepoetin alfa 和 EPO-XL 的位点特异性N-和 O-糖基化分析。
先前的研究表明，与 Asn24 相比，Asn38 和 Asn83 位点的唾液酸化对增强 EPO 活性和延长其半衰期的影响更大。带有扩展 LacNAc 结构的高唾液酸化 EPO 与增强的体外和体内生物活性有关。在本研究中，Asn38 和 Asn83 主要被 EPO-XL 和 darbepoetin alfa 中的四唾液酸化聚糖占据，其中 EPO-XL 显示出相对较大的 LacNAc 结构，与其改进的疗效一致。对于共同O-糖基化位点 Ser126，两种蛋白质表现出相似的聚糖组成。在 EPO-XL 中鉴定出一种新的O-糖基化位点 Ser120，其中只有一种糖型 H1N1S1被观察到，研究者推测这多出来的唾液酸化修饰可能有益于其活性。
通过分析每个糖基化位点上多个糖基释放肽的液相色谱峰面积来研究位点占用率。表2的N糖基化位点占有率都显示出高糖基化的特征。由于缺乏通用的O-糖苷酶，对O-糖基化位点占有率的系统评估仍然具有挑战性，但可以通过分析O-糖肽及其相应的非糖基化肽的相对丰度来估计。该分析表明，占有率约为 90% 或更高。
表 2.Darbepoetin Alfa 和 EPO-XL 中的 N-糖基化位点占用率
总的来说，该研究首次揭示了hyperEPO蛋白的位点特异性N-和O-糖基化谱，为hyperEPO蛋白的糖基化质量控制和合理设计提供了重要参考。该研究方法为高度糖基化蛋白的精准表征提供了有效手段，具有广泛的应用潜力。
[1] Wu, S. et al. Unveiling the Accurate Site-Specific N- and O-Glycosylation of Hyperglycosylated Erythropoietin Drugs by an Integrated Approach. Anal. Chem. (2025) doi:10.1021/acs.analchem.5c02433.
