酶法异戊二烯化修饰大幅增强抗菌肽膜靶向活性

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为"Expanding the Chemical Space of Antimicrobial Peptides via Enzymatic Prenylation"。通讯作者是日本静冈大学的Daisuke Fujinami教授和Sohei Ito教授，课题组聚焦于酶催化修饰与抗菌肽功能调控研究。

在应对全球耐药菌感染的挑战中，抗菌肽（AMPs）因其独特的膜靶向机制备受关注，但天然肽存在膜渗透性不足与稳定性缺陷。本研究创新性地利用异戊二烯化转移酶PalQ对含色氨酸的抗菌肽进行精准修饰，通过引入分支状异戊烯链增强膜相互作用。

作者首先从APD3数据库筛选8种结构多样的抗菌肽（包括Plantaricin A、Ci-MAM-A24等），经AlphaFold2预测显示其涵盖β-折叠、α-螺旋及无规卷曲构象。实验发现PalQ可高效催化C端色氨酸异戊二烯化，其中Ci-MAM-A24的C5-二甲基烯丙基化率达100%，而难修饰肽段如TAT-Ras通过-1/-2位点甘氨酸取代使效率从0%提升至80%。这种甘氨酸依赖的增效机制源于其破坏C端二级结构，促进色氨酸深入酶活性中心——分子对接模拟显示，肽段8557经双甘氨酸取代（M10G/L11G）后形成延伸构象，与PalQ的Q197形成氢键锚定，质谱检测到明确的+68 Da质量位移。

令人惊讶的是，当使用C10-香叶基供体时，Ci-MAM-A24-COOH（2b）意外发生双位点修饰。HPLC分离出单修饰与双修饰产物，质谱解析证实N端和C端色氨酸同时被香叶基化。为阐明N端修饰的化学本质，作者合成模型肽段WKRFH并通过NMR分析，发现香叶基连接于色氨酸Cδ2位，这是首次报道的Cδ2烷基化修饰类型。膜相互作用分析进一步显示，香叶基化显著增强脂质结合——添加 deuterated DPC后，香叶基周边碳原子化学位移扰动>0.15 ppm，证实其直接参与膜锚定。

活性提升与膜作用强化直接相关。对大肠杆菌的抑制实验表明，Ci-MAM-A24经C5/C10修饰后IC₅₀从216.6 μM降至53.2 μM。更具突破性的是，Plantaricin A的C10-香叶基化使对乳酸杆菌活性提升18倍（IC₅₀ 114.7→6.3 nM），分子动力学模拟揭示其色氨酸Cγ原子插入脂质双层深度增加40%。这种膜扰动能力通过碘化丙啶渗透实验验证：香叶基化肽处理乳酸杆菌后，荧光强度随浓度梯度上升，表明膜完整性破坏。值得注意的是，相较于传统N-酰化修饰，C10-香叶基化PA-Win对大肠杆菌抑制活性提升15倍（105.0→7.2 μM），而相同链长的N-酰化仅提升5倍，凸显异戊烯链的立体分支结构对膜靶向性的独特优势。

为克服PalQ应用瓶颈，作者通过PROSS平台进行酶工程改造。针对阳离子抗菌肽与阴离子酶的静电聚集问题，设计PalQ_PROSS突变体（23个位点替换）。该变体在1 M NaCl或50%乙腈中溶解度提升3倍，并在687 mM NaCl/34% DMSO体系中实现难溶肽8557的高效修饰。进一步对供体结合域改造，将I79/M82/Y85/F86突变为丙氨酸，成功将供体范围拓展至C20-香叶基香叶基焦磷酸——质谱检测到PalX肽段+272 Da质量位移，为抗菌肽疏水性精准调控提供新工具。