摘要
氟苯尼考因其突出的有效性和安全性，已被多国授权用作兽药，每年的需求量达到3000吨左右。氟苯尼考的工业生产主要使用硫酸铜，造成了严重的环境污染。此外，该过程产生一对非对映异构体，其中只有一个可以转化为氟苯尼考。另一个异构体虽可以转化为氟苯尼考，但过程非常复杂。因此，几种基于醛缩酶或转醛酶合成氟苯尼考手性中间体L-苏式-对甲磺砜基苯丝氨酸的方法被开发出来，但该中间体转化为氟苯尼考，需要通过酯化和还原将末端羧基转化为羟基。
近期，上海交通大学林双君教授所在团队在对转酮酶和转氨酶催化机制和蛋白结构认识基础上，利用分子对接手段建立了酶-底物结合模型，并基于此设计半理性突变策略，翻转了转酮酶的立体选择性，转氨酶的对映体偏好性和醛酮选择性，进而偶联转酮酶和转氨酶突变体一锅法合成了末端羟基手性中间体(1R,2R)-对甲磺砜基苯丝氨醇，产率可以达到76%，非对映体选择性最高为96% de 和对映体选择性> 99% ee，为氟苯尼考的制备提供了最直接的手性中间体。
02 内容 基于设计，作者从一系列转酮酶和转氨酶中筛选出能有效催化起始底物醛1的转酮酶突变体EcTK1和有效催化转酮酶产物2氨基化的ω-转氨酶ATA117。为了考察转酮酶的立体选择性，作者建立了一个通过非手性液相测定2立体构型的方法，即偶联一个对2基本无立体选择性的R-转氨酶突变体ATA117_AC，将(S)-和(R)-2分别转化成(1S,2R)-和(1R,2R)-3。从而可以确定EcTK1是S-选择性的，催化产生的羟酮中间体为S-构型（93.3% ee）(图1)。由于所设计的路线是合成R-羟酮中间体，因此作者基于转酮酶的蛋白质结构和催化机制对该酶作了半理性改造。首先将底物醛1对接进EcTK1晶体结构的活性口袋中 (图2A)，发现醛羰基与H26和H261存在氢键相互作用，而F434位于醛羰基的背面。因此提出一个假设，如果通过氨基酸突变改变醛羰基的定位，那么很有可能会改变羟酮产物的立体构型。为了翻转醛羰基的朝向，作者采用了“破而后立”的策略，即先打破现有的氢键相互作用，而后建立新的氢键相互作用。通过迭代的饱和突变和理性突变，获得了立体选择性完全翻转的EcTK1_YYF和EcTK1_YYH突变体，ee(R)分别为91.6%和95.2% (图1)。通过将突变体EcTK1_YYH与底物醛1进行分子对接，证实了醛羰基的朝向的确发生了翻转，与背面的Y434形成了新的氢键(图2B)。 图2. 转酮酶EcTK1 (A)和EcTK1_YYH (B)与醛1的分子对接 在实现转酮酶的立体选择性翻转后，作者基于R-2底物与ATA117_AC的分子对接，对转氨酶作了迭代饱和突变，筛选所得突变体ATA117_ACHH翻转了对手性羟酮中间体2的对映体偏好性和醛酮底物选择性，即从野生型ATA117对S-酮的偏好性(Es=8.5)翻转为突变体ATA117_ACHH对R-酮的偏好性(ER=11.7) (图3)；从野生型ATA117对醛的偏好性翻转为突变体ATA117_ACHH对酮的偏好性。为了考察ATA117_ACHH对R-酮的偏好性，分别作了ATA117_ACHH与-S酮2b和R-酮2a的分子动力学模拟，证实氨基供体PMP的氨基与R-酮的羰基距离在3.5Å左右，而与S-酮羰基距离为10-30Å (图4)。 图4. 分子动力学数据的统计 在获得了合适的转酮酶和转氨酶突变体之后，将两个酶偶联一锅反应合成了目标产物氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-对甲磺砜基苯丝氨醇，产率为76%，非对映选择性为96% de和对映选择性> 99% ee，并且进一步将该级联反应拓展到其他一系列对位取代的苯甲醛，合成了相应的(1R,2R)-对位取代的苯丝氨醇衍生物，产率为51-80%，de为95-97%。 论文的通讯作者为上海交通大学生命学院林双君教授，设计了整个课题；论文的第一作者为上海交通大学生命学院刘琦，执行了大部分实验；论文的第二作者为上海交通大学生命学院谢欣悦，负责分子动力学模拟计算。该工作得到上海交通大学多位老师的指导和建议，在此表示衷心感谢！该工作得到了国家重点研发计划项目(2018YFA0901900)和国家自然科学基金项目(21632007，31425001)的支持，一并表示感谢。
