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JACS | 硫代葡萄糖/葡萄糖氧化酶介导的H2O2/H2S双释放系统

今天给大家分享一篇近期发表在JACS上的文章,题为A Sweet H2S/H2O2 Dual Release System and Specific Protein S-Persulfidation Mediated by Thioglucose/Glucose Oxidase。文章的通讯作者是来自布朗大学的Ming Xian教授。

H2O2H2S是两种在氧化还原生物学中发挥调节作用的分子,在许多生理病理过程中起重要作用。H2O2H2S各自具有不同的信号通路,但同时二者间也具有通讯作用,通常是以对信号通路中其他靶标的间接作用实现的。例如,一种重要的蛋白质翻译后修饰-过硫化(-SSH)并不能直接由H2S-SH反应得到,而是H2S-SHH2O2氧化产物,-SOH反应的结果。

目前为止,已开发出多种活性氧及活性硫的供体分子,可以在不同条件下响应释放,他们不仅是重要的研究工具,同时也是潜在的治疗剂。但这一方面的研究仍存在一定局限性。首先,大部分供体为合成材料,不可避免会产生有机副产物。另外,目前的供体均只能产生单一种类的活性分子,这很难模拟H2O2H2S同时存在时的协同效应。

在本文中,作者设计了一种巧妙的体系解决上述问题。如图1所示,一种重要的氧化还原酶,葡萄糖氧化酶(GOx),可以将β-D-葡萄糖氧化为葡糖酸内酯,同时释放H2O2。依据这一过程,作者设想将1-硫代-β-D-葡萄糖作为GOx的底物,则产物硫代葡糖酸内酯水解将释放H2S。也就是说,硫代葡萄糖/葡萄糖氧化酶的组合可以介导H2O2/H2S双释放,并且无其他毒性副产物。更进一步地,作者设想H2O2/H2S双释放可能诱导蛋白产生过硫化。

1.  硫代葡萄糖/GOx双释放H2S/H2O2并诱导蛋白过硫化的设计思路


为验证可行性,作者首先测试了GOx作用下H2S的释放,以亚甲基蓝方法定量H2S。实验结果如图2A所示,硫代葡萄糖在缓冲液中自身稳定,存在GOx时则有显著H2S释放。同时,在优化后的条件下(10μM硫代葡萄糖、10 μg/mL GOx),H2S的释放表现出缓慢、连续、时间依赖的性质。

考虑到同时产生的H2O2H2S可能会相互反应,生成多硫化氢(H2Sn),降低H2S的有效浓度。作者也进行了实验探究,通过荧光探针监测H2Sn的生成。实验结果如图2 B所示,反应1 h的荧光可以忽略不计。以上的结果表明,硫代葡萄糖/GOx体系在适当的反应条件下(1 h)能够以可控方式双释放H2O2/H2S

2. 硫代葡萄糖/GOx体系H2S释放曲线


接下来作者探究硫代葡萄糖/GOx体系是否能够诱导蛋白质过硫化。事实上,蛋白的-SHH2O2氧化为-SOH,随后与H2S反应得到-SSH的过程需要4 mMH2O22 mMH2S,这样的高浓度在生物体系是无法应用的,并且可能产生不同氧化程度的副产物。而本文开发的缓慢连续H2O2/H2S释放可能具有优势。作者将BSA与硫代葡萄糖/GOx共同孵育,并使用荧光探针与串联质谱的方法检测过硫化修饰。实验结果如图3所示,A图中h列有明显荧光,B图中确认了Cys34为过硫化位点,证明蛋白成功获得了过硫化修饰。

3. A) 荧光探针检测过硫化修饰 B) LC-MS/MS确认过硫化修饰位点


已经证明了硫代葡萄糖/GOx可以在生物允许的条件下实现双释放,作者随后探究这一体系的可调性:使硫代葡萄糖响应特定刺激而产生。作者的第一个尝试是制备双酶体系(图4A),引入β-半乳糖苷酶及其底物硫代乳糖,只有在双酶存在时,β-半乳糖苷酶水解硫代乳糖得到硫代葡萄糖,并进一步被催化才能释放H2O2/H2S。除此之外,作者设计了响应-SH的硫代葡萄糖二硫化物(图4B)。这两种设计都经过了实验验证,具有时间依赖的H2S释放。这种可调性使硫代葡萄糖部分可以被设计作为前药,响应特定生物学条件被激活,递送H2O2/H2S

4. A) β-半乳糖苷酶双酶体系的H2S释放曲线 B) 硫代葡萄糖二硫化物体系的H2S释放曲线


综上所述,本文中作者设计了由硫代葡萄糖/葡萄糖氧化酶组成的稳定、可控H2O2/H2S双释放系统,并且能够产生有效的蛋白质过硫化修饰。与此同时,该系统高度可调,可以设计其他因素进一步控制H2O2/H2S的释放。


作者:ZRC    审校:WGQ

DOI: 10.1021/jacs.1c06372

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.1c06372


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