分享一篇发表在 PNAS 上的文章，标题为“Metabolic control of glycosylation forms for establishing glycan-dependent protein interaction networks”，通讯作者是来自华盛顿大学的 Benjamin A. Garcia 教授和复旦大学粤港澳大湾区精准医学研究院的谢一轩研究员，Benjamin A. Garcia 教授主要从事蛋白和核酸修饰与表观遗传等相关质谱的测定及工具开发，谢一轩课题组聚焦于 RNA 糖基化及糖组学，蛋白质组学，表观组学的测定与分析。

GAP-MS 技术是对培养细胞中糖链的代谢调控（使用称为糖链修饰剂的小分子）与亲和纯化后进行质谱分析的流程相结合（图 1）。作者选用了岩藻糖（Fucose）、3-氟代唾液酸（3-F-Sia）和 α-甘露糖苷酶I抑制剂（Kif）等糖链修饰剂对培养细胞中的糖链进行代谢调控（图 1B），在岩藻糖基化缺陷的人结直肠癌细胞系 HCT116 发现了唾液酸化（S）、未修饰（Undec 或 Und）、岩藻糖基化（F）、唾液酸岩藻糖基化（FS）和高甘露糖基化（HM）五种主要的糖链表型（图 1C），每种表型均以特定糖链形式的显著增加为特征。因此作者进一步推测这种控制糖链表型的体系可以与亲和纯化-质谱联用（AP-MS）以鉴定由于糖链形式改变而导致的 PPIs 的变化，理论上适用于任何可以在 HCT116 细胞中外源表达的目标糖蛋白（图 1A）。作者进一步选择了四种诱饵糖蛋白，包括免疫球蛋白 BSG、表皮生长因子受体（EGFR）、CD44 和氨基酸转运蛋白重链 SLC3A2 四种（图 1E），通过 GAP-MS 发现 156 种高置信度相互作用，其中近 45% 是新发现的，展示了 GAP-MS 在监测糖蛋白相互作用方面的灵敏度，并且大多数相互作用（156 种中的 131 种）参与构建了糖链依赖性蛋白质相互作用组（GDPI）。

为验证糖链修饰剂是否能够改变糖型，作者对五种条件下培养的 N-糖链进行糖组分析。通过对 PNGase F 释放所提取到细胞膜 N-糖链，并对 N-糖链进行图谱分析（图 2A）。作者发现天然 HCT116 细胞完全缺乏岩藻糖基化，且以唾液酸化糖链（S 型）为主。同时，岩藻糖处理后的细胞产生了唾液酸岩藻糖基化糖链（SF型），而 3-F-Sia 和岩藻糖联合处理则使糖链转化为岩藻糖基化糖链（F 型），仅用 3-F-Sia 处理可产生超过 55% 未修饰糖链（无唾液酸或岩藻糖，Undec 型），高甘露糖基化糖链的相对丰度存在变化，这归因于糖链离子化效率的差异。最后，甘露糖苷酶抑制剂处理后的细胞中超过 95% 为高甘露糖基化糖链（HM 型），突出了 HCT116 细胞在生理条件下的独特糖链特征（图 2B）。作者进一步以 CD44、BSG、EGFR 和 SLC3A2 糖蛋白为诱饵，启动了对糖链依赖性 PPIs 的鉴定工作。为了确认过表达的诱饵蛋白上的糖链能够被糖链修饰剂充分调控，作者阐明了这四种蛋白在稳定表达诱饵蛋白的细胞系中的位点特异性糖肽信息（图 2C），在五种条件下主要产生了具有不同 N-糖型的诱饵糖蛋白并于上述结果一致，证明了 GAP-MS 的稳健性。

随后作者采用数据独立采集（DIA）蛋白组学工作流程，鉴定并定量与诱饵蛋白共纯化的蛋白，从 4 种诱饵蛋白的 GAP-MS 分析中鉴定出 85 种相互作用蛋白和 156 种相互作用关系（图 3A），并在其中发现 66 种相互作用在 STRING 或 BioGRID 数据库中未被记录，因此被认为是通过 GAP-MS 平台新鉴定出的。作者统计了来自四种诱饵蛋白的富集糖蛋白数量，发现有 26 种蛋白是糖基化的，涵盖了 53 种相互作用。并且不同捕获蛋白的相互作用边中发现 85 种蛋白中有 47 种（>55%）具有不止一种相互作用以及 26 种糖蛋白中近 60%（15 种）被不止一种诱饵蛋白富集，展示了细胞膜糖萼的整合性和复杂性。作者进一步对网络中的蛋白进行了基因本体（GO）富集分析，对于生物过程，分析显示与运输、定位、细胞黏附及其他细胞过程相关的类别显著过表达。分子功能分析确定了高度富集的类别，如转运活性、催化活性和各种结合功能——这些特征与细胞表面环境的动态和互动特性紧密吻合（图 3B，3C）。理论上，在每种糖链表型下，总网络中的 156 种相互作用可分为三类：a) 被糖链主要形式增强的相互作用；b) 在该类型中受阻的相互作用；c) 未受强烈影响的相互作用。基于平均 TopS 分数，作者为所有糖链表型生成了 5 个增强子网络（包含 TopS 分数 > 20 的相互作用）和 5 个抑制子网络（包含 TopS 分数 < -20 的相互作用）（图 3D-3M）。