分享一篇发表在Nat Commun上的文章，文章题目为“Screening macrocyclic peptide libraries by yeast display allows control of selection process and affinity ranking”，文章通讯作者是威尼斯大学的Alessandro Angelini助理教授。

大环肽作为一种新兴的药物种类，具有较高的亲和力和选择性，且蛋白水解稳定性较好。目前已经开发了许多技术来发现新的大环肽配体，比如噬菌体展示、mRNA展示等。尽管这些方法能够生成和筛选大型且结构多样的大环肽库，但是它们的筛选过程较为繁琐，筛选过程中难以监测，得到候选分子的序列之后，需要经过后续的化学合成和纯化步骤才能得到可用于亲和力表征的肽配体。

针对这些缺点，作者开发了一个基于酵母展示的新型筛选策略，可以对筛选的过程进行调控，并对候选克隆进行亲和力排序。该方法的核心是：先构建编码结构多样化的二硫键环化肽（包括单环、双环的拓扑结构）的酵母展示文库，在筛选的时候，先进行两轮传统的“结合-洗涤-洗脱-扩增”筛选过程，然后利用荧光激活细胞分选技术（FACS）对得到的酵母细胞进一步筛选，为了实现对筛选过程的调控，作者设计了一个双色荧光标记系统，一个荧光探针用于检测大环肽的表达水平（这里是检测HA-tag来衡量大环肽的表达），另一个荧光探针用来检测靶蛋白（靶蛋白被生物素修饰，故使用生物素的抗体来实现对其检测）。通过这种双色标记，FACS可以对酵母细胞进行逐一分析，并绘制“表达水平-结合能力”散点图，从而筛选出那些与靶标结合能力较强的酵母细胞。筛选得到这些酵母细胞之后，作者一方面对它们的单克隆进行测序，另一方面将酵母克隆与一系列梯度稀释的靶蛋白进行孵育，通过FACS检测不同靶蛋白浓度下的结合荧光信号，可以绘制出每个克隆的结合等温线，从而计算出表观解离常数。

通过该方法，作者从文库中针对5种完全不同的蛋白靶点，筛选得到了nM级甚至pM级的特异性大环肽配体，通过对其中一个最优分子与靶蛋白复合物的X射线晶体结构解析，作者从原子层面揭示了其高亲和力的分子基础，进一步验证了该筛选方法的精准性和可靠性。

总而言之，本文将酵母展示技术与FACS结合，提供了一种快速发现大环肽配体的简单、过程可视、结果可量化的新方案。

本文作者：LZ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41467-025-60907-x

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-60907-x