监测细胞内生物分子的动态定位对于深入理解生命活动的时空调控机制具有重要意义。为实现对特定生物分子的可视化，研究人员已开发出多种化学和生物标记策略，广泛应用于活体系统中。例如，通过基因工程或代谢工程手段，可将荧光或化学标记引入蛋白质、糖链等大分子中；而对于核苷酸、脂类等小分子，则通常采用体外合成带有功能性标签的类似物，再将其导入细胞或生物体内。标记后的分子通常通过荧光团修饰进行可视化，其方法包括免疫标记、金属络合、蛋白–配体识别、生物正交反应及酶催化反应等。

炔基标签因其结构小巧、化学惰性和生物相容性，在活体成像中表现出极大的优势。炔基可通过铜(I)催化的叠氮–炔烃环加成反应（CuAAC）与叠氮功能化探针进行高效、特异性的生物正交标记，该反应适用于细胞表面及体内环境。此外，炔基还具有独特的拉曼光谱信号，可在无需荧光染料的情况下实现非侵入性和实时成像。

在此基础上，作者提出了一个假设：若将炔基设计为光激活型，则可在特定区域经光照后选择性激活其反应活性，从而实现分子标记的空间和时间调控，推动对分子动态过程的可视化研究。此前已有研究使用 DBCO 作为光敏炔基标签，实现细胞表面分子的光控标记。DBCO 因其环辛炔结构产生的应变，可在无铜条件下与叠氮化物发生应变促发型环加成反应。然而其高反应性也导致在生理环境下易与细胞内的巯基（如谷胱甘肽）发生非特异性反应，限制了其在胞内的应用。

为克服上述限制，作者设计并合成了一种新型光激活炔基标签分子，其核心在于通过引入光可降解保护基团稳定炔基中间体。在水溶液及生理条件下，该标签可在 365 nm 紫外光照射下解笼，转化为具有末端炔烃结构的活性分子（图 1）。

图 1：光激活线性炔烃标记的分子设计及其在细胞内的应用

图 2a：笼状炔烃前体 1 光转化为相应炔烃 2 的反应；图 2b：化合物 1 在有无光照下的核磁共振氢谱

作者测定了炔基前体化合物 1（0.1 mM）在不同光照强度（0–10 J^cm⁻²）下的紫外–可见光（UV–Vis）吸收光谱。结果表明，随着光照强度的增加，其在 350 nm 处的吸收逐渐减弱（图 3）。该变化在 8 J^cm⁻² 以上趋于饱和，此时的浓度较高，是为了确保能在吸收光谱中检测到结构转化。验证了炔基前体 1 在水溶液中可在生物相容剂量的光照条件下转化为炔类产物 2，实现了预期的光诱导结构激活。

图 3：在 0 到 10 J ^cm−2 不同光照强度下，光笼炔烃前体 1 的吸收光谱

接着，带有炔基标签的胆固醇类似物 3（图 4a）引入活细胞中，用于开展光诱导炔基标记实验。将化合物 3 与 HeLa 细胞共孵育，随后使用油酸处理细胞 1 天（油酸是脂滴的强诱导剂），以增强胆固醇类似物在脂滴上的富集与定位，便于在细胞中清晰地观察其分布。油酸诱导后，对细胞进行光照，促使胆固醇类似物 3 在细胞内发生光转化，生成末端炔烃化合物 4。完成光激活标记后，细胞被固定，并进行染色处理，以在显微镜下观察炔基标记。

在荧光显微图像中，除了细胞核内部，整个细胞内均可清晰观察到颗粒状和纤维状结构（图 4e,f）。因此，推测荧光信号主要均匀分布于包裹细胞器和脂滴的脂质膜上。这种荧光分布图像与孵育非笼化炔基胆固醇化合物 5 的阳性对照组细胞非常相似（图 4c,d）。相反，在未接受光照的细胞中，孵育了光笼化炔基胆固醇化合物 3 后几乎未观察到荧光信号（图 4g,h）。通过图像分析对每个细胞中的荧光区域进行定量（图 4k），结果显示，光照与未光照组之间的荧光水平存在显著差异。这些结果明确表明，大部分的光笼化炔基胆固醇 3 在光照后被成功转化为末端炔类化合物 4。

图 4：光诱导活细胞中炔烃标记的激活

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本文作者：WJ

原文链接：

https://doi.org/10.1002/cbic.202500190