共价探针揭示RNA的小分子结合口袋

分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目为“Covalent Probes Reveal Small-Molecule Binding Pockets in Structured RNA and Enable Bioactive Compound Design”，通讯作者是来自Scipps研究所的Matthew D. Disney教授，他的研究方向聚焦于RNA化学生物学和靶向治疗研究。这篇文章中，作者报道了利用光交联探针识别结构化RNA的小分子结合口袋。

SARS-CoV-2移码刺激元件（FSE）是一段高度结构化的RNA，其假结区在冠状病毒中高度保守，具有作为广泛抗病毒药物靶点的潜力。因此作者希望利用化学交联和下拉分离（Chem-CLIP）策略鉴定SARS-CoV-2 FSE的小分子结合口袋。

作者首先选择具有抗病毒活性的美拉沙星进行SARS-CoV-2 FSE的小分子结合研究。他们首先合成了一组在美拉沙星不同位置引入双吖丙啶交联基团和炔基手柄的Chem-CLIP探针，并测试探针与SARS-CoV-2 FSE在体外的共价反应。浓度依赖性和竞争性标记实验确定了Chem-CLIP 2和4是最适合进一步研究的探针。

随后作者使用美拉沙星衍生探针对SARS-CoV-2 FSE的小分子结合口袋进行识别。将RNA与探针孵育后，通过紫外照射使探针与RNA中的邻近核苷酸共价交联，共价探针的炔基手柄用于与叠氮-生物素通过点击化学连接，从而使用链霉亲和素选择性富集交联RNA，再通过逆转录酶进行逆转录，随后利用纳米孔测序以核苷酸分辨率识别突变的交联位点。结果确定了核苷酸12-17和27-28是显著的配体结合位点。

为了研究美拉沙星是否会改变FSE的构象，作者采用了DMS-MaP作为互补策略，检测配体诱导的RNA结构扰动。结果显示美拉沙星诱导假结区核苷酸可及性的明显变化。作者也通过分子对接对美拉沙星和SARS-CoV-2 FSE的结合模式进行了验证和解释。

后续，作者进一步探索了Chem-CLIP策略的潜力。通过Chem-CLIP对189个功能化RNA结合片段文库进行筛选，确定了9个可以与FSE特异性结合的片段。通过竞争性Chem-CLIP策略研究了69种美拉沙星衍生物与FSE的结合，共41种化合物可以产生明显竞争，其中8种可以抑制细胞报告基因测定中的移码活性。