光笼线性双泛素-Dha与生物素化线性Fab协同实现活细胞互作蛋白时间分辨分析

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为"Synergizing Structure-Guided Photocaged Linear Diubiquitin-Dha with Biotinylated Linear-Fab for Time-Resolved Profiling of Interactors in Living Cells"。通讯作者是上海交通大学的于圆圆教授与合肥工业大学的李宜明教授，课题组分别专注于化学蛋白质组学和蛋白质化学合成领域。

多聚泛素化是一种动态可逆的翻译后修饰，通过八种不同拓扑链结构（如M1线型、K48、K63等）调控真核细胞进程。其中，线型多聚泛素由线性泛素组装复合物（LUBAC）合成，并由OTULIN特异性去泛素化酶清除，在TNF-α信号通路和细菌感染等生理过程中具有关键作用。然而，线型泛素链细胞内丰度极低（＜0.2%总泛素链），传统抗体或亲和体工具难以捕获其互作蛋白，尤其缺乏时间分辨率以解析动态过程。现有策略如线性特异性抗体或合成抗原结合片段（sAB）虽能鉴定部分互作蛋白，但无法在活细胞中实现分钟级动态监测，且对低丰度信号灵敏度不足。

为解决这一挑战，研究团队提出了一种协同策略：通过光控OTULIN抑制剂瞬时阻断线型泛素链水解，放大内源性信号，再结合生物素化线性Fab进行时间分辨富集。该策略核心是设计了一种新型光激活抑制剂线性-diUbp-Glu16(4-甲氧基-7-硝基吲哚啉,MNI)-脱氢丙氨酸(Dha)。其设计基于OTULIN独特的"近端泛素激活"机制——线型双泛素中近端泛素Glu16残基通过插入催化中心激活OTULIN。团队在Glu16羧基侧链引入光裂解基团MNI，使其在黑暗条件下无活性，经365纳米紫外光照射后释放活性羧基，触发OTULIN共价交联。化学合成中，他们通过固相肽合成与天然化学连接构建线性双泛素骨架，并在G75位点引入Dha弹头，最终获得高纯度抑制剂（分离产率8.2%）。

体外实验表明，该抑制剂在黑暗条件下不与OTULIN结合，紫外照射5分钟后即可形成共价复合物（交联效率约80%），且对K48或K63特异性去泛素化酶无交叉反应。为提升细胞穿透性，团队进一步将环状十精氨酸细胞穿膜肽（cR10）与抑制剂偶联，并利用DABCYL修饰增强胞内递送效率。共聚焦显微镜证实，修饰后抑制剂在HeLa细胞中呈现均匀分布，且MTT实验显示细胞毒性可忽略。

在功能验证中，研究者将抑制剂应用于TNF-α刺激的HeLa细胞和M-CSF诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）。紫外激活抑制剂后，免疫印迹检测到线型泛素链丰度在5分钟内提升约10倍，且Co-IP实验验证了NEMO、N4BP1等已知互作蛋白的结合增强。通过定量质谱分析，团队在TNF-α刺激模型中鉴定到280个显著富集的互作蛋白（fold change＞1.5, p＜0.05），包括STAT3、TRAF6等NF-κB通路关键分子；在BMDMs中发现234个互作蛋白，如HOIP、OPTN等。值得注意的是，该策略在遗传操作困难的原代细胞中同样成功捕获到线型泛素动态互作网络。