原代神经元的活体光邻近标记技术揭示钙信号传导途径

分享一篇发表在Cell chemical biology上的文章，题目为“Photo-proximity labeling in live primary neurons identifies an AMPA-receptor signal transducer in homeostatic synaptic plasticity”，通讯作者是来自波士顿大学的Andrew Emili和Heng-Ye Man教授、以及一作是来自俄勒冈健康与科学大学的Avik Basu研究员，他们的研究方向为利用组学技术研究生物体中大分子的相互作用和探究神经发育中的分子过程。

神经元的突触表面分布着大量的离子通道蛋白，这些离子通道蛋白对不同离子的选择通透性在调节神经元细胞响应外界扰动的过程中起到至关重要的作用，例如表达GluA1的AMPA复合物对钙离子有更高的通透性，以维持突触稳态，但目前尚未发现其下游相关的钙传感器蛋白。

邻近标记策略在研究相互作用蛋白中是一种有力的手段，但通常依赖于对靶蛋白进行基因编码。在原生状态下通过邻近标记技术鉴定互作蛋白有一定挑战性，本文应用了一种新型的基于抗体的光催化邻近标记技术，用于研究原代神经元细胞中GluA1的相互作用蛋白。基本原理为，作者首先使用针对GluA1亚基的一抗，对GluA1进行捕捉，随后使用偶联有核黄素四乙酸RFT标记的二抗进行孵育，形成光催化基团-抗体-靶蛋白复合物后，使用450 nm的光进行短暂照射，以在受体周围诱导局部的邻近生物素化的标记。整个蛋白质组学工作流程之后包括生物素富集、On beads酶切后通过TMT标记，作者与对照组比较后选择Fold change>1.5，p.value<0.05的组别定义为GluA1的相互作用蛋白。

作者在可选的蛋白靶标中关注到NCS1蛋白，这是一种钙离子感知蛋白，他们通过免疫染色证明了在兴奋性突触区域，NCS1和GluA1存在共定位，并且通过免疫共沉淀等方法再次验证了两种蛋白间有较强的相互作用。作者通过邻位连接技术PLA表明两个蛋白的相互作用在树突沿线的突触位点处较为显著，表明了互作的空间特异性，作者也通过分子对接确认了GluA1和NCS两个蛋白互作的热点残基。