借助持续进化获得更亮的荧光素酶变体

分享一篇最近发表在 ACS Chemical Biology上的文章，本文的题目是“Continuous Hypermutation and Evolution of Luciferase Variants”。本文的核心是作者们开发了一种基于正交DNA复制系统（OrthoRep）的连续定向进化平台，并将其成功应用于荧光素酶GeNL的快速优化，获得了能更高效利用廉价底物腔肠素（coelenterazine, CTZ）的突变体。本文的通讯作者是来自加州大学欧文分校的 Chang C. Liu 和 Jennifer A. Prescher。本文的核心是开发了一种基于正交DNA复制系统（OrthoRep）的连续定向进化平台，并将其成功应用于荧光素酶GeNL的快速优化，获得了能更高效利用廉价底物腔肠素（coelenterazine, CTZ）的突变体。

传统的荧光素酶优化流程（如易错PCR）通常涉及多轮费时费力的体外突变库构建、转化和手动筛选，成为限制开发效率的主要瓶颈。为解决这一问题，研究者转向了连续定向进化策略。他们选用了OrthoRep系统，该系统通过在工程化酵母细胞内利用一个定制的易错DNA聚合酶（BadBoy2），专一性地、高速率地突变一个独立于基因组的质粒（p1），从而实现对目标基因的持续超突变，无需反复的体外克隆操作。研究者选择绿色增强型纳米灯笼（GeNL）作为模型酶进行优化。GeNL由NanoLuc荧光素酶和荧光蛋白mNeonGreen通过BRET效应构成，其最优底物是合成分子呋喃嗪（Fz），但天然底物CTZ价格更低廉。为了便于筛选并避免底物细胞渗透性的潜在问题，研究者将GeNL与酵母表面展示蛋白Aga2融合，构建了可表面展示GeNL的OrthoRep酵母菌株。

实验过程中，研究者仅通过简单的连续传代培养（共七轮，历时不到两个月）使GeNL基因自然积累突变，然后对每代约96个克隆进行发光筛选。他们发现，从第一代（P1）开始就出现了发光强度显著高于亲本的种群（如P1-72），且后续优势种群均溯源于此。经过几轮进化，筛选出的突变种群使用CTZ的发光强度比初始种群提升了3-10倍。

对优势突变体进行测序后，研究者鉴定出四个关键氨基酸替换（L243I, H312Y, D147Y, I284T），其中L243I和H312Y位于NanoLuc的底物结合口袋附近。通过分子对接分析，他们推测L243I（对应NanoLuc中的L18）可能通过改变与CTZ的疏水相互作用来提升催化效率。后续在酵母和哺乳动物细胞中的功能验证表明，L243I单点突变即可使CTZ下的发光强度提升约5倍，且不影响其与Fz的反应活性及BRET效率，凸显了该位点的重要性。