分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Low-Background Cancer Imaging with a Bioorthogonal Fluorescence Probe and Engineered Reporter Enzyme Bearing a Targeting Moiety”。通讯作者是来自东京大学的Yasuteru Urano教授和Ryosuke Kojima副教授，他们的研究方向是化学探针设计与医学转化应用。

在癌症切除手术中，通过荧光指导精准识别肿瘤边界是提高预后的关键。目前的常用策略是将报告酶与肿瘤靶向抗体结合，通过酶促反应激活荧光探针。然而，传统的报告酶探针（如β-半乳糖苷酶系统，LacZ）往往缺乏足够的生物正交性，极易被哺乳动物组织中广泛表达的内源性酶非特异性激活，从而产生高背景信号。为了解决这一难点，本研究致力于寻找一种在人体内完全不被识别、只有遇到外源报告酶时才会被点亮的“生物正交”系统。作者提出了一种“锁与钥匙”的设计思路：将荧光母体HMRef与糖基结合，利用糖基的位阻效应使探针在未激活状态下因分子内螺环化而处于荧光猝灭状态，只有当特定的外源糖苷酶切除糖基后，探针才会重新恢复绿色荧光。

基于此，研究者构建了一个包含8种糖基修饰的探针库，并在小鼠主要器官裂解液中进行筛选。实验结果显示，常见的β-D-半乳糖（β-D-Gal）和β-D-葡萄糖（β-D-Glc）在多个器官中均被激活，而β-D-岩藻糖（β-D-Fuc）在所有测试器官中均表现出极佳的稳定性，展现出完美的生物正交性。在锁定探针后，作者从一种源自堆肥微生物元基因组的数据库中，寻找到了能够水解β-D-Fuc的糖苷酶Td2F2。在加入Td2F2后，HMRef-β-D-Fuc溶液的荧光强度随时间呈显著且快速的线性增长，证明了酶对探针的有效激活。随后的活体实验进一步证实，β-D-Fuc探针在小鼠腹腔内的荧光背景极低，显著优于传统系统。然而，作者发现肿瘤部位的信号亮度明显弱于经典的LacZ系统，问题源于野生型Td2F2较低的催化效率。

接下来，作者对Td2F2进行了定向进化改造。首先利用易错PCR（error-prone PCR）构建了包含超过107个随机突变体的基因库并转化进大肠杆菌中进行表达。随后加入SPiDER-β-D-Fuc探针，该探针被水解后不仅能释放荧光，还能生成高活性的中间体并共价锚定在胞内蛋白上。这种“原位捕获”机制确保了荧光强度与酶活性之间的对应机制，从而通过FAC筛选出高活性细胞。经过四轮筛选，研究者获得了突变体Mutant A（包含E27G, I34T, F243L, E296G四处突变），其催化效率kcat/Km 相比野生型提升了7.3倍。

最终的活体成像验证展示了该系统的卓越性能。通过将Mutant A与靶向抗体或纳米抗体结合，小鼠体内的微小癌结节被清晰地“点亮”。定量分析表明，Mutant A产生的荧光强度显著高于WT，接近LacZ，并且Mutant A系统的肿瘤/肠道信噪比显著优于传统的LacZ系统。

综上所述，本研究结合了生物正交化学与蛋白质工程的策略，为临床精准肿瘤切除提供了极具前景的成像工具。

本文作者：TZM

责任编辑：TZS

DOI：10.1021/jacs.5c14173

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c14173