分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Co-Translational Incorporation of (R)- and (S)-β2-Hydroxyacids In Vivo: Directed Evolution of Efficient Aminoacyl-tRNA Synthetases”。通讯作者是波士顿学院的Abhishek Chatterjee教授，课题组专注于遗传密码扩展与合成生物学研究。
将具有非天然骨架的单体掺入活细胞表达的蛋白质中，是合成序列定义生物聚合物的关键，但在工具酶开发和翻译系统兼容性上面临双重瓶颈。传统的氨酰-tRNA合成酶定向进化策略依赖于翻译偶联的报告蛋白的表型筛选，但对于其氨基或羟基偏离α-碳的非α-氨基酸而言，它们对内源性翻译机器（如延伸因子EF-Tu或核糖体）耐受性差，因此这类筛选策略失效。
为解决此问题，本研究应用了一种此前开发的、不依赖核糖体翻译的筛选平台——START，对Methanomethylophilus alvus的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶进行定向进化，成功获得了可高效、特异性地将多种β2-羟基酸、β2-氨基酸和丙二酸单体装载到其同源tRNA上的MaPylRS突变体，并首次在真核细胞中实现了非α-氨基酸骨架的共翻译掺入。
START平台的核心原理在于将每个aaRS突变体的身份与其催化的tRNA酰化事件直接关联，而无需经过蛋白质翻译。研究人员首先构建了一个庞大的MaPylRS突变体文库，通过随机化其活性中心四个关键残基，获得了约1.6×10^5种理论变体。与此同时，他们构建了一个携带N15条形码的tRNAMaPyl文库，每个条形码唯一对应一个aaRS突变体。当活性突变体在非α-氨基酸存在下，成功酰化其关联的条形码tRNA时，该tRNA的3’-末端因被氨基酰基保护而可抵抗高碘酸盐氧化，进而在后续的逆转录和测序步骤中被识别和富集。利用该平台，研究人员以(R)-β2-BocK、(S)-β2-BocK两种β2-氨基酸和一种丙二酸衍生物为底物，对文库进行了筛选。通过分析条形码在添加与不添加非经典单体条件下的富集情况，并结合序列一致性分析，成功鉴定出了一批具有潜力的候选突变体，如MMIF、FCVF、MCVG和MMLI。
为了验证这些候选突变体的活性，研究团队开发了一种优化的tRNA延伸测定法。由于某些非α-氨基酰基-tRNA酯键在标准条件下难以水解，他们巧妙地改为直接比较在非经典单体存在与否时，tRNA被DNA聚合酶延伸的程度：未酰化的tRNA可被延伸，而已酰化的则不能，从而直观反映酰化水平。利用该方法，证实了多个突变体在对应单体存在下能有效酰化tRNAMaPyl。例如，MaPylRS-MMIF和FCVF对丙二酸单体3显示出活性。为进一步确认酰基的身份，他们采用了3’-腺苷保留tRNA分离（PARTI） assay，通过质谱直接分析从细胞裂解物中分离出的tRNA所携带的酰基。结果证实，在MaPylRS-MMIF和丙二酸3存在下，tRNAMaPyl上携带的正是目标丙二酸单体（检测到其脱羧产物）。有趣的是，对商业来源的β2-氨基酸1和2的PARTI分析发现，主要酰化产物并非预期氨基酸，而是其对应的β2-羟基酸杂质4和5。随后的实验验证了MaPylRS-FCVF确实能以高活性酰化(R)-和(S)-β2-羟基酸4和5。
通过体外酰化实验，研究人员进一步系统评估了突变体的底物谱和相对效率。结果表明，部分突变体展现出显著的多特异性。例如，MaPylRS-MMIF不仅能有效酰化β2-羟基酸4和5，还能酰化高纯度的β2-氨基酸6以及经典的α-氨基酸BocK 7。而MaPylRS-FCVF和MMLI对BocK 7的活性则很弱。这突显了START能够成功改变MaPylRS的底物偏好，使其从α-氨基酸转向非α-骨架单体，并且所得突变体的多特异性有助于未来应用于更多样化的非经典单体。
随后，研究评估了这些高效酰化酶能否驱动非α-单体在活细胞中的共翻译掺入。在携带琥珀密码子（TAG）的纳米荧光素酶报告系统中，共表达tRNAMaPyl和MaPylRS-FCVF或MMIF。在添加(R)-或(S)-β2-羟基酸4或5后，观测到了依赖于单体添加的强烈荧光素酶活性，其中MaPylRS-MMIF活性更高，且(R)-型单体4的掺入效率（约达野生型蛋白的20%）优于(S)-型5。纯化蛋白质的质谱分析证实了目标单体的成功掺入，并观察到掺入位点（位于蛋白质N端柔性区）的酯键在细胞内发生部分水解。而在添加β2-氨基酸6的条件下，未检测到显著掺入，这可能与细胞内酰化效率不足及翻译系统处理能力有限有关。重要的是，此前研究表明EF-Tu与携带β2-羟基酸的tRNA结合较弱，本工作中高效aaRS/tRNA对驱动了成功的掺入，表明高效的氨酰化至少可以部分克服EF-Tu结合力弱的限制。
最具突破性的进展在于，研究首次将这项技术拓展至真核系统。将表达MaPylRS-MMIF或FCVF及其tRNA的质粒与携带TAG密码子的EGFP报告基因共转染至HEK293T细胞，在添加β2-羟基酸4或5后，观察到了显著的EGFP表达，而在对照组中则没有。MaPylRS-MMIF再次表现出更高的活性，能够以相近的效率（约为野生型EGFP的2-3%）掺入两种对映体，其中(S)-型5的掺入效率略高于(R)-型4，这与在大肠杆菌中的趋势相反，暗示了原核与真核翻译系统的差异。从大量细胞中纯化得到的掺入了(S)-β2-羟基酸5的EGFP蛋白，经质谱和碱处理实验证实，位于蛋白质结构内部的酯键在细胞内保持稳定。这证明了在真核细胞中进行非α-骨架遗传编码的可行性。
总而言之，本研究利用不依赖翻译的START定向进化平台，成功改造了PyIRS，使其能够高效装载包括β2-羟基酸在内的多种非α-氨基酸单体。所获得的工程酶不仅在大肠杆菌中实现了高效、高保真的掺入，更首次在哺乳动物细胞中演示了非α-骨架单体的共翻译掺入，将遗传密码扩展技术的边界从侧链化学多样性推进到了骨架多样性。这项工作为未来在活细胞内合成具有非天然骨架的序列定义生物聚合物，并应用于生物学、医学和材料科学领域，奠定了关键的酶学工具基础。
本文作者：TZS
责任编辑：ZCL
DOI：10.1021/jacs.5c18595
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c18595
