分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Bioluminescent Probes for Multiplexed RNA Imaging。本文通讯作者是加州大学欧文分校化学系的Andrej Lupták教授和Jennifer A. Prescher教授。Andrej Lupták教授的研究方向是结合体外筛选与生物信息学方法，发现并设计功能性RNA（如核酶和适配体）以揭示细胞调控新机制，并重点开发新型荧光/发光工具来实现活细胞内RNA的高时空分辨率动态追踪。Jennifer A. Prescher教授的研究方向是发展新型探针监视细胞网络。

全面了解RNA生物学功能需要能够在生理环境中可视化转录本及其相互作用的方法。传统的原位杂交等方法只能在固定样本中提供RNA定位的静态快照，无法捕捉其动态变化。现有的动态光学探针主要依赖于荧光工具，例如通过将噬菌体外壳蛋白（如MCP和PCP）与分裂的荧光蛋白融合来识别特定的MS2/PP7 RNA适体标签（tag）。然而，荧光成像需要外部激发光，这在长时间成像中会导致细胞毒性和光漂白。此外，为了获得足够的信噪比，传统的荧光方法通常需要引入多个适体拷贝，这会形成庞大的标签结构，进而可能干扰目标RNA的正常定位、动态变化和下游功能。因此，研究人员迫切需要能够在生理环境（活细胞或活体系统）中持续、非侵入性地同时追踪多种RNA的新技术。

本研究开发了一种模块化的“RNA lantern”平台，利用split NanoLuc荧光素酶（NanoBiT）结合生物发光共振能量转移（BRET）技术，实现了无需外部激发光的多色多重RNA成像。研究人员设计了三种正交探针，将荧光素酶小片段（SmBiT）与MS2外壳蛋白（MCP）融合，并将大片段（LgBiT）分别与PCP、Nun和L7Ae这三种不同的RNA结合蛋白融合 。通过在LgBiT融合结构中插入不同的荧光蛋白（VenusΔC12和mScarlet-I），当这些探针结合到含有特定刚性适体标签的目标RNA上时，能够特异性地组装并发出蓝色、黄色或红色生物发光信号。

为了最大化生物发光信号的强度，研究团队在体外对RNA标签的结构几何形状进行了系统性优化，精细调整了MS2与正交适体之间的核苷酸间距。他们发现，改变适体间的空间距离和螺旋相位角会显著影响分离荧光素酶片段的互补重组效率。这些经过优化的正交RNA tag在宽泛的浓度范围内均表现出极其严格的特异性，能够精准触发其对应的同源RNA lantern，且未检测到任何交叉反应或信号串扰。

这些优化后的多色正交探针随后被直接应用于活体哺乳动物细胞中，以同时追踪多种特定转录本的时空动态定位。研究人员巧妙地引入了先前开发的生物发光相量分析技术（Nat. Methods 2022, 19 (7),893-898, DOI: 10.1038/s41592-022-01529-9），无需切换滤光片即可在单帧图像中成功解析并分离荧光素酶宽泛且重叠的发射光谱。借助这种创新的高分辨率成像手段，他们成功在同一个活细胞内清晰地区分并定位了两种分布截然不同的RNA靶标，准确验证了NEAT1长链非编码RNA的细胞核定位，以及β-actin mRNA在细胞质中的广泛分布。

该探针平台扩展了多重RNA成像的工具库，为在活体中追踪RNA动态变化提供了新方案。由于完全不依赖外部激发光源，生物发光避免了传统荧光技术常伴随的光毒性和光漂白问题，这使其非常适合对活细胞乃至整个生物体进行长周期的连续非侵入性成像。在底层设计上，该探针平台被证实具有高度的模块化和正交特异性，这意味着未来在进一步整合其他替代蛋白对时只需进行极少的优化即可直接应用，且完全避免了探针间的串扰现象。同时，由于优化后的新型结构化RNA标签尺寸非常小（仅约65至83个核苷酸），研究预期其对天然目标转录本在空间定位、生理动态和天然降解速率方面的干扰将被降至最低。最终，通过成功地将正交多色 lantern探针与生物发光相量分析技术相结合，该研究在单细胞层面上实现了具有良好亚细胞分辨率的同步多靶标成像，为未来更深入地进行内源性转录本的多重成像工作奠定了坚实基础。

本文作者：WJJ

责任编辑：WYJ

DOI：10.1021/jacs.5c16597

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16597