从"一步到位"到"两步选择"——复旦团队在邻近标记技术上的一小步创新，如何解决了RNA低丰度标记的一大痛点？
新闻速览
2025年12月，复旦大学附属肿瘤医院/生物医学研究院团队在《Nature Communications》发表研究，开发了一种名为FISH+（Highly Selective In Situ Proximity Labeling）的新型RNA邻近生物素标记技术。 该技术在传统APEX2邻近标记基础上引入"两步筛选"策略，大幅提升了RNA标记的选择性和信噪比，为低丰度RNA的亚细胞定位和RNA-蛋白互作研究提供了强有力的新工具。
一、研究背景：RNA邻近标记的挑战
1.1 为什么要标记RNA？
RNA分子的功能远不止于遗传信息的"信使"。随着研究的深入，科学界发现RNA在亚细胞器中的精准定位对其功能发挥至关重要——某些mRNA需要被运输到特定位置的"翻译工厂"，而lncRNA和circRNA则在特定亚细胞区域执行调控功能。
1.2 传统方法的局限
APEX2（工程化抗坏血酸过氧化物酶）是目前最主流的邻近标记酶之一，通过H₂O₂和生物素-苯酚底物在邻近蛋白上产生自由基介导的生物素化。然而，当目标从蛋白转向RNA时，问题出现了：
丰度差异巨大：蛋白通常在微摩尔级别，而RNA（尤其是低表达lncRNA/circRNA）可能只有几个拷贝/细胞
标记底效率：生物素-苯酚自由基对RNA的反应性低于对蛋白的反应性
高背景噪声：非特异性标记叠加低起始量，信噪比严重不足
二、FISH+的核心创新
2.1 "两步选择"策略
FISH+的创新在于将传统的"一步标记"拆分为"两步选择"：
第一步：邻近生物素标记
利用APEX2或其他邻近标记酶，在H₂O₂作用下对诱饵蛋白邻近的RNA进行生物素标记
这一步与传统方法相同，标记半径约20-200 nm
第二步：靶向RNA的二次富集
设计针对目标RNA序列的反义寡核苷酸探针（生物素化探针）
将"已被邻近标记"的RNA与"靶向捕获探针"进行杂交
只有同时携带两种不同生物素信号的RNA分子才能被最终富集
这种逻辑等同于"双重验证"——一个RNA分子必须在空间上邻近诱饵蛋白（条件一），同时序列匹配目标RNA（条件二），才会被纳入分析。这大幅降低了假阳性率。
2.2 正交生物素系统的运用
FISH+的一个关键技术细节是使用了两种不同修饰的生物素探针：
APEX2邻近标记：使用含炔基的生物素-苯酚（alkyne-biotin-phenol），标记后通过CuAAC点击化学偶联序列捕获所需的"把手"
靶向杂交探针：使用含不同修饰（如可裂解生物素）的反义寡核苷酸
这种正交设计确保了只有真正邻近的RNA而不是"被杂交探针非特异性吸附的RNA"被最终分离。
三、关键实验结果
3.1 选择性验证
研究团队将FISH+应用于线粒体RNA的亚细胞定位研究：
将APEX2融合到线粒体外膜蛋白，对线粒体邻近RNA进行标记
比较了传统APEX2-RNA标记和FISH+的信噪比
FISH+将目标RNA的高信噪比提升了10-50倍
3.2 低丰度RNA检测
在细胞核lncRNA NEAT1和MALAT1的定位验证中，FISH+成功检测到传统APEX2方法无法分辨的亚细胞分布差异。这表明FISH+尤其适合低拷贝数RNA的研究。
3.3 适用性
研究团队在HeLa和HEK293T两种细胞系中验证了FISH+的通用性，并在APEX2和BioID（BirA*）两种邻近标记平台上进行了交叉验证。
四、FISH+对比现有方法
五、潜在应用场景
5.1 RNA亚细胞定位图谱
FISH+的"高选择性"特性使其特别适合构建特定细胞器的RNA定位图谱，尤其是鉴定那些定位在非常规位置（如线粒体表面、应激颗粒、P-body）的低丰度RNA。
5.2 RNA-蛋白互作网络
通过固定诱饵蛋白并利用FISH+鉴定与其邻近的RNA，可以构建RNA结合蛋白（RBP）的RNA"客户"网络。
5.3 疾病机制研究
在癌症和神经退行性疾病中，RNA的错误定位（mislocalization）是重要的致病机制。FISH+提供了高灵敏度的工具来捕捉异常的RNA定位事件。
5.4 药物作用机制研究
利用FISH+可以评估小分子药物是否影响特定RNA的亚细胞定位或RNA-蛋白互作，为新药作用机制的阐明提供信息。
六、对生物素标记试剂的新需求
FISH+的成功验证对生物素标记试剂提出了新的要求：
可裂解生物素探针：用于温和释放捕获的RNA，保持其完整性
不同活性的生物素-苯酚衍生物：优化标记效率和自由基半衰期
定点生物素化寡核苷酸：用于序列特异性杂交探针的制备
七、展望
FISH+的出现标志着邻近标记技术从"泛标记"向"精准靶向"的升级。随着技术创新不断降低RNA标记的技术门槛，RNA亚细胞定位研究将进入一个新的高度——未来的RNA生物学不再是试管里的反应，而是在活细胞内"看见"RNA的一举一动。
纳孚生物关注邻近标记和RNA生物学的技术前沿，提供FISH+等技术所需的生物素标记试剂（Biotin-Phenol、Alkyne-Biotin-Phenol、可裂解Biotin-NHS等），以及定制化生物素探针合成服务。
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