分享一篇发表在Science Advances上的文章，文章标题为“N-glycosylation as a eukaryotic protective mechanism against protein aggregation”。其通讯作者是来自鲁汶大学的Joost Schymkowitz教授和Frederic Rousseau教授，他们课题组的研究重点是了解蛋白质折叠和错误折叠的机制及其与人类疾病的关系。
可溶性功能蛋白向结构化聚集体的转化是由被称为易聚集区(aggregation-prone regions, APRs)的连续疏水氨基酸触发的。在球状蛋白中，APRs大多位于疏水核心内，然而，在生理应激或翻译和易位过程中，APRs会暴露于溶剂中并易于诱导蛋白聚集，因此需要细胞蛋白稳定机制的严格调节。但是，蛋白的不溶性聚集体会导致蛋白质的功能丧失，并且通常对细胞有害，这种毒性与人类疾病和衰老密切相关，包括阿尔茨海默病和帕金森病。 APR 的进化持久性是其对蛋白稳定必要性的结果，因为驱动聚集的力（即疏水性氨基酸和β片层）对于球状蛋白的折叠也至关重要。然而，抑制聚集倾向的氨基酸残基，即门控位点残基(gatekeeper residue)，例如带电氨基酸（Arg、Lys、Asp 和 Glu）和脯氨酸 （Pro） 在紧邻 APR 的区域富集，因为它们在动力学和热力学上不利于聚集，会减弱APR的作用。由于其抗聚集特性，这些氨基酸残基对于维持细胞的整体适应性至关重要。 大多数蛋白质都存在翻译后修饰(PTM)，以帮助蛋白质折叠并增加天然结构的稳定性。许多 PTM 的化学性质让人联想到门控位点残基，携带负电荷的残基（Asp 和 Glu）常用于模拟蛋白的磷酸化状态，带正电荷的残基（Arg 和 Lys）容易受到许多类型的 PTM 的影响，例如乙酰化或甲基化。由于这些原因，作者假设 PTM在整个进化过程中可能在 APR 的侧翼被选择为保护蛋白质免受聚集的内在因素，从而扩大了当前聚集门控位点的范围。
作者首先利用蛋白质聚集预测因子 TANGO鉴定了所有 APR ，发现未被修饰的门控位点残基（Arg、Lys、Asp、Glu 和 Pro）在紧邻 APR 的位置富集。因此，为了研究PTM作为门控位点的潜在可能系，作者计算了它们在人类APR中及APR周围的相对富集度（图1A）。接下来，从dbPTM和O-GlcNAcAtlas收集已在人类蛋白质中实验鉴定的 PTM 位点，并将其映射到数据集中，发现在数据库中的571,759 个PTM位点中主要有 17 种 PTM 类型。
图1 APRs和GRs中不同PTM类型的相对富集度
分析结果表明，PTMs在APRs和GRs中通常是水平较低的（图1B、C），这意味着大多数PTM类型更频繁地出现在远离APRs的残基中。但是，与分析的所有其他PTM类型相比，N-糖基化在APR和GR中大量富集，特别是在N端（图1C）。 由于TANGO是基于序列的预测因子，作者还评估了上面检测到的富集是否是源于Asn-X-Thr / Ser序列极性的假阳性。作者比较了实验验证的可以进行N-糖基化(SP glycosylated)的基序的相对富集与未糖基化(SP nonglycosylated)或由于其亚细胞位置而不能糖基化的序列（non-SP），结果显示，仅在SP glycosylated序列的 APR 和 GR 中观察到N-糖基化修饰的富集（图 2A）。此外，在由与SP蛋白(SP randomized)或非SP蛋白(non-SP randomized)相同氨基酸组成的人工蛋白质中不存在N糖基化的富集，进一步表明它不是由序列引起的（图2A）。总之，这些结果表明，在 APR 和 GR 中观察到的糖基化序列的富集不是由于序列组成或聚集预测因子的选择引起的偏差，而是 N-糖基化修饰增加的直接结果。
图2 APR 和 GR 中 N-糖基化修饰的功能评估
N-糖基化效率受糖基化受体位点的一级序列环境影响很大，因此，作者还研究了在 EP 中观察到的强选择是否源于序列与OST的优先结合。结果表明，与其他N-糖基化位点相比，EP中的N-糖基化效率反而相对较低（图2D）。这表明序列组成并没有驱动这些区域中糖基化位点的增加，因此暗示了N-糖基化在这些位点存在实际的功能作用。同时，与所有其他N-糖基化以及非糖基化序列相比，EP中的N-糖基化修饰位点具有更高的保守性（图2E）。作者在其他动物和植物的SP蛋白中也发现了类似的富集模式（图2F）。以上结果表明相关位点的N-糖基化修饰在高等真核生物中具有类似的功能作用，可以防止蛋白聚集。
图3 EP 处的 N-糖基化残基充当聚集门控位点。
APR 两侧未修饰的门控位点残基（Arg、Lys、Asp、Glu 和 Pro）的存在和数量与其聚集倾向密切相关。作者发现，在 GR1 N-ter 和 GR2 N-ter 处存在 N糖基化修饰的APR 比在相同位置没有N糖基化修饰的 APR 具有更高的聚集倾向（图 3A），因此，此PTM可能同样具有抑制蛋白聚集的功能。 为了更深入地了解N-聚糖作为聚集门控位点的作用，作者以基底细胞粘附分子蛋白（BCAM；图 3C）第 439 位的 N-糖基化位点为例。作者发现在 BCAM 直系同源物中的相同区域中具有更多数量的未修饰的门控位点（平均超过两个；图 3C）。这也是 GR1 N-ter 上大多数 N-糖基化位点的普遍规律，即使是那些靠近非常强的 APR 的位点（图 3D）。 蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族具有同样的特点。作者发现许多细胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂具有糖基化基序，其侧翼是非常强的APR，该APR在两个进化枝中都是保守的（图3，E和F）。然而，在细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂中，该APR的侧翼是一个或多个未修饰的门控位点残基，再次证明了N-聚糖和未修饰的门控位点残基的类似功能（图3F）。
图4 N-糖基化多肽的体外分析
图5 N-糖基化可防止难以折叠的蛋白质的聚集
作者随后使用随机森林分类器预测了需要N-聚糖保护的APR，带有 APR 的域的相对接触顺序是模型中最重要的特征（图 5B）。虽然没有受保护的APR的高接触顺序结构域通常具有较低的聚集倾向，但在EP处具有N-糖基化位点的结构域通常包含更强的APR（图5C）。因此，N-糖基化保护具有总体高聚集倾向的复杂结构域的 APR。N-糖基化限制了部分 APR 的溶剂可及性以避免空间冲突，而之前的分析表面，N-糖基化取代了 EP 上未修饰的门控位点残基（图 5B）。 作者随后研究了不同 CATH 结构域架构中受保护的 APR 的相对丰富程度。结果表明，α类结构域相对丰富程度较低，而β折叠相关结构域更加丰富（图5E）。特别是β-三明治结构高度富集（图5E、F）。β-夹心结构域的特征是两个相对的反平行 β 片层，形成结构域交换错误折叠物种的风险更高。对 β-夹心结构域的更深入分析表明，EP 上具有 N-糖基化位点的结构域比其余 β-夹心结构域具有更强和更高数量的 APR（图 5G）。此外，在较大的多结构域蛋白中发现了含有受 N-聚糖保护的 APR 的 β-夹心结构域（图 5H ）。 N-糖基化在糖蛋白质量控制中起着至关重要的作用（图 5I），作者使用定量蛋白质组学在HEK-293细胞中鉴定了 71 种真正的人 UGGT 底物。与其他糖蛋白相比，EP 中含有 N-糖位点的蛋白质在 UGGT 底物中显着富集（图 5J）。以上研究结果表明，N-聚糖对 APR 的保护与蛋白质折叠的生物物理特性有关，例如结构更为复杂、具有更多APR 和更高聚集倾向的蛋白更倾向于存在N-糖基化的保护。
图6 Neuro2a 细胞中 N-糖基化的缺失特异性地增加了蛋白质聚集
如果 N-糖基化是真核生物中对抗蛋白质聚集的常见机制，那么它的抑制作用应该会影响蛋白质组中蛋白质的溶解度。使用衣霉素可以完全抑制 N-糖基化（图 6A），会导致 ER 内错误折叠和聚集。为了研究哪些特定糖蛋白在没有 N-糖基化的情况下聚集，作者发现，用衣霉素处理后，通过串联质谱 (MS/MS) 鉴定出 EP 处有 N-糖基化位点的蛋白质中，约 20% 变得更加不溶（图 6B）。当分析用衣霉素处理后溶解度更高的蛋白质时，没有发现 EP 处具有 N-糖基化位点的蛋白质富集（图 6B）。通过观察其他四种应力下蛋白质溶解度的变化来进行相同的分析，然而，这些都不会影响其溶解度（图 6 C-F）。总之，这些结果表明，抑制 N-糖基化会导致蛋白质溶解度降低，特别是在 N-聚糖充当聚集门控位点的蛋白质中（图 6G）。
总之，研究表明，在近千种人类蛋白质中，N-聚糖是富集的、高度保守的，并且通常取代序列片段中未修饰的聚集门控残基。此外，作者还发现 N-聚糖在体外抑制 APR 的聚集，并且在小鼠 Neuro2a 细胞中的抑制会导致新制造的蛋白质发生特异性聚集。总之，这些发现表明，在其众多分子功能中，N-糖基化构成了直接致力于控制真核生物中蛋白质聚集的功能机制。 文章作者：HYD DOI：10.1126/sciadv.adk8173
