介绍的是最近在JACS上报道的一篇标题为 “Targeted Dephosphorylation of Tau by Phosphorylation Targeting Chimeras (PhosTACs) as a Therapeutic Modality” 的文章。该文的通讯作者是耶鲁大学化学系的Craig M. Crews教授。Craig M. Crews教授课题组致力于发展小分子蛋白质靶向降解剂，是PROTAC技术的鼻祖之一。在本文中，作者开发了一种去磷酸化靶向嵌合体PhosTAC，能够招募一种细胞内的天然去磷酸化酶PP2A来靶向对Tau蛋白进行去磷酸化，以实现治疗的目的。
Tau蛋白是一种微管相关蛋白，对于微管的组装和稳定有重要的影响，其异常的聚集与多种神经退行性疾病的形成有关。最近有报道发现，Tau蛋白的过度磷酸化经常在阿尔兹海默症患者的大脑中被发现，并且其Thr231位的磷酸化会影响其与微管蛋白的结合，影响下游作用。也有研究表明Tau蛋白的过度磷酸化会诱导其异常聚集，而去磷酸化则可以显著抑制这一过程。人们还发现Tau蛋白Ser262和Ser356位的磷酸化会减弱HSP70蛋白的识别，从而阻止其被细胞自身的蛋白酶体系统降解。总而言之，尽管机理仍在讨论和研究中，但过度磷酸化被广泛认为是Tau蛋白相关疾病的潜在治疗靶点。 在神经细胞中，PP2A是Tau蛋白去磷酸化过程的主要磷酸酶。因此，作者团队开发了一种去磷酸化靶向嵌合体PhosTAC，通过将磷酸酶招募到目标蛋白上，实现目标蛋白的靶向去磷酸化。在之前的研究中，Crews课题组已经成功通过PhosTAC对PDCD4和FOXO3a这两种蛋白进行了靶向去磷酸化。在本研究中，他们用这种方式来诱导Tau蛋白的靶向去磷酸化。(图1A)图1. Tau蛋白靶向磷酸化靶向嵌合体（PhosTACs）的设计以及Tau突变体-Halotag-荧光蛋白融合基因的设计和表达 作者团队首先进行了概念验证实验。他们构建了诱导表达的Tau蛋白突变体基因2N3R*和2N4R**，并分别与两种荧光蛋白和Halotag融合。荧光显微镜表明了在诱导后2N3R*和2N4R**的成功表达，并用免疫印迹的方式确定了这两种突变后的Tau蛋白很容易出现Thr231位的磷酸化，并且不能被一些常见的激酶抑制剂（除雷帕霉素外）抑制。雷帕霉素是一种已经报道过可以被用于Tau磷酸化水平抑制的分子。由于PP2A还没有特异性的配体分子，作者团队设计了一个FKBP12-PP2A融合蛋白，将FKBP配体分子与一段卤代烃相连，构建了用于概念验证的PhosTAC7和PhosTAC7F。（图1B-E） 作者首先验证了PP2A-PhosTAC-Tau三元复合物的形成。Halotrap下拉实验表明了连接有Halotag的PhosTAC与Tau蛋白结合，再与PP2A共沉淀表明有三元复合物的形成。并且PhosTAC的诱导表达引发了显著的Tau蛋白Thr231位磷酸化的消除，而且在改换为氟代Halotag(一种没有连接能力的卤代烃)以及用PP2A抑制剂(冈田酸OA)处理后这种去磷酸化现象消失。证明了去磷酸化是由于三元复合物的形成以及PP2A相关的途径介导的。(图2)图2. 基于Halotag的PhosTAC7以pp2a依赖的方式去磷酸化Tau蛋白 接下来，作者团队构建了能直接结合Tau蛋白的PhosTAC，他们用基于正电子发射断层扫描(PET)的Tau蛋白示踪剂PI-2620作为Tau蛋白配体，并且构建了一系列基于多个PEG的连接子将PI-2620和FKBP配体相连。Western Blot结果表明，当聚乙二醇单元为8个时(Tau2-8)，对Thr231位去磷酸化的效率最优，1 μM处理时即有50%的去磷酸化效率。用OA处理以及构建PP2A P179R突变体(对去磷酸化结合口袋中的关键氨基酸进行突变)均能抑制去磷酸化过程，证明了这个过程是PP2A活性依赖的。(图3)图3. 基于Tau蛋白配体的几种PhosTACs(Tau2-8)的分子设计及去磷酸化能力表征 接下来，作者团队研究了PhosTAC去磷酸化的动力学特点。他们发现Tau2-8和PhosTAC7类似，在1 μM处理2小时内就能实现50%去磷酸化，最终24小时后去磷酸化效率约为75%。他们还使用了洗脱实验来确认PhosTAC的催化性质，在更换正常培养基培养的24小时内，PhosTAC7和Tau2-8仍具有强效的去磷酸化能力。他们还将PhosTAC介导的去磷酸化和已知的Tau去磷酸化药物雷帕霉素相对照，发现雷帕霉素几乎在洗脱后24小时内完全失效，证实了PhosTAC与PROTAC一样有着亚化学计量的催化活性。(图4)图4. Tau蛋白的PhosTACs有着快速且持久的去磷酸化作用 最后，作者团队验证了对Tau蛋白去磷酸化是否能加速Tau蛋白异常聚集体的降解。他们使用流式细胞术分析了表达Tau突变体-荧光蛋白融合基因的细胞中的荧光强度，发现在PhosTAC7处理后，荧光强度有明显的降低。这个过程在细胞内蛋白酶体抑制剂MG132的处理下，证明了对Tau蛋白去磷酸化后，能有效介导其被细胞自身的蛋白酶体系统降解。揭示了对Tau蛋白进行靶向去磷酸化在疾病治疗中的应用潜力。(图5)图5. PhosTAC对Tau蛋白去磷酸化后的下游生物学效应，即诱导Tau聚集体的加速降解 综上所述，该团队构建了一种能够对Tau蛋白Thr231位靶向去磷酸化的小分子嵌合物PhosTAC。通过概念验证实验、复合物形成验证以及降解效率和动力学表征，全方位地证明了PhosTAC可以介导Tau蛋白有效的去磷酸化，并能促使Tau蛋白被细胞自身所降解。这种方法为如神经退行性疾病和肌萎缩等由Tau蛋白异常聚集导致的多种疾病提供了有前景的治疗方案。DOI: 10.1021/jacs.2c11706Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c11706
