分享的是一篇发表在JACS上的文章，标题是“Structurally Specifc ZDNA Proteolysis Targeting Chimera Enables Targeted Degradation of Adenosine Deaminase Acting on RNA 1”。本文的作者是来自哈佛医学院的Wenyi Wei和西奈山治疗中心发现西奈山伊坎医学院的Jian Jin.
基于 DNA 和 RNA 的 PROTAC 的普遍进步，仍然需要探索和扩展更具体的工具，从而扩大基于 DNA 的 PROTAC 的范围。与传统的 A 型或 B 型 DNA 不同，Z 型 DNA 是一种仅在特定条件下和特定靶序列下表现出来的构型，可以被特定的读取蛋白（如 ADAR1 或 ZBP1）识别，以发挥下游生物学功能。
ADAR1（作用于RNA1的腺苷脱氨酶）是一种复杂参与RNA编辑过程的关键酶，特别是在双链RNA分子腺苷转化为肌苷的过程中。其影响涵盖一系列疾病，尤其是其在癌症中的过度表达及其与自身免疫性疾病的复杂相互作用（图1A）。鉴于ADAR的多方面结构域结构，所报道的抑制剂仅靶向催化编辑依赖性结构域，而细胞环境中的其他编辑独立功能未受影响，这影响了其潜在的治疗能力。因此，出现了一种更具说服力的策略，即靶向ADAR1进行降解，考虑到ADAR1对Z-DNA的独特和固有的亲和力，其特征是其糖-磷酸盐的Zig-Zag构象骨架（图1B），在PROTAC设计中引入Z-DNA作为基础元素是最佳和可行的选择。
Z-PROTAC可以通过将针对ADAR1癌蛋白精心定制的Z-DNA结合部分与E3连接酶配体连接来设计。在相互作用时，PROTAC协调ADAR1与E3泛素连接酶的紧密接近，触发ADAR1泛素化过程，并随后被26S蛋白酶体降解。作者在本文中设计了一种基于Z-DNA的蛋白质水解靶向嵌合体（Z-PROTAC）（图1C）。合成了一种Z型寡脱氧核苷酸（Z-DNA），其作为复杂募集ADAR1的配体，与VHL配体偶联，用于选择性募集VHL E3连接酶。这种策略性设计劫持了泛素化过程，最终导致ADAR1的精确降解。Z-PROTAC的构建是通过无铜菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成（SPAAC）反应获得的。
图1. Z-PROTAC劫持VHL E3连接酶靶向降解细胞中的ADAR1
使用电泳迁移率位移测定 （EMSA）确认通过 Z-22 抗体结合的Z-DNA 形成, Z-DNA在特定条件下出现，包括特定（GC）n重复序列、增加的超螺旋以及转录、复制和染色质重塑过程中的蛋白质结合，环境的pH和离子等因素进一步促进Z型DNA的形成。作者设计了一种具有（CG）6序列的合成DNA构建体，表示为FAMDNA 2，并在DNA 2的5′末端战略性地引入和合成了一个5，6FAM荧光标签用于追踪。随后，使用各种离子，如NaCl和CoCl3，来诱导Z-DNA的形成（图2A）。在不同的离子条件下培养这些构建体以产生Z型DNA（图2A），然后进行电泳迁移率偏移测定（EMSA）实验（图2B）。诱导的FAM-Z-DNA 2表现出对Z-22抗体的亲和力，而非转化的FAM-B-DNA 2没有这种相互作用，这是由EMSA测定有效捕获的辨别。如图2C所示，将初始量的0.5μM FAM-TRF DNA、FAM随机DNA和FAM-DNA 2引入补充有/不补充3M NaCl的EMSA缓冲液中，促使Z-DNA形成。随后，将上述含有DNA的预混缓冲液与未稀释的Z22抗体（1μg）混合，并在室温下再孵育30分钟。然后将所得混合物进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳以实现结合的（FAM-Z-DNA）和未结合的FAM-DNA 2（FAM-B-DNA 2）的分离。结果表明，3M NaCl可以诱导Z-DNA而对照DNA（TRF或随机DNA）没有类似的反应。随后的研究涉及与Z22抗体和FAM-Z-DNA 2浓度升高相结合的离子条件的系统探索（图2D，E）。此外，使用圆二色性（CD）测定法来确认NaCl或CoCl3诱导的Z-DNA构象的形成。总之，研究结果证实了Z-DNA在剂量依赖性中表现出与Z22抗体结合的倾向，并证明了通过暴露于3M NaCl，可对Z-DNA 2有效诱导。
图2. 离子诱导FAM-Z-DNA的形成和电泳迁移率偏移分析（EMSA）检测FAM-Z-DNA和Z22抗体之间的结合。
图3. ADAR1蛋白与生物素-Z-DNA结合
Z-PROTAC诱导的ADAR1在HeLa细胞中降解。为了评估Z-PROTAC对ADAR1蛋白的降解潜力，使用HeLa细胞系作为代表性的细胞模型。合成了17个PROTAC，统称为Z-PROTA 1c−17c（图4A,4B）。之后通过脂质体介导的转染以5 μg/mL的浓度进入HeLa细胞，并收集细胞裂解物用于蛋白质印迹分析。
图4. Z-PROTAC针对ADAR1进行降解
图5. Z-PROTAC对ADAR1的降解可有效诱导肿瘤细胞的细胞死亡。
图6. 与非癌正常细胞相比，ODN（Z-DNA）、8c和9c对癌症细胞中细胞信号传导的功能影响的分析。
总之，本文工作将 Z 型 DNA 与 ADAR1结合，其降解是通过利用与 Z 型 DNA 偶联的 VHL 配体来募集 E3 连接酶来实现的。这种巧妙的构象产生了一系列Z-PROTAC，利用这些Z-PROTACs来选择性地降解Z-DNA结合蛋白ADAR1。基于Z-DNA的PROTAC（Z-PROTAC）方法引入了一种由B-型到Z-型DNA的构象变化产生的模式，它利用固有的结构特异性来增强选择性降解策略。该方法是推进基于PROTAC的治疗模式的一个鼓舞人心的途径，强调了其在PROTAC治疗领域中选择性靶向不可治疗蛋白质的潜力。
本文作者：SY
原文引用：10.1021/jacs.3c13646
责任编辑：LD
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