推荐一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章，其标题为“A Genetically Encoded Homocysteine Precursor to Probe Protein Active Sites and to Addict Escherichia coli to a Noncanonical Amino Acid Directly Involved in Catalysis”。本文通讯作者是来自德国明斯特大学生物化学研究所的Henning D. Mootz教授，其课题组致力于通过化学和基因工程学的策略，为目的蛋白赋予新的生物学功能。本文中，作者设计并合成了化学基团保护的非天然氨基酸高半胱氨酸，并通过遗传密码子拓展技术插入到目的蛋白的关键残基上，最终实现目的蛋白的可控激活。

高半胱氨酸（homocysteine）由于其优秀的反应性，两亲性以及较小的尺寸，而广受蛋白质结构功能相关研究者的关注。此前研究中，通过蛋白质半合成等方式引入的高半胱氨酸往往由于无法复刻天然蛋白结构，而不能有效展现其生物学效应。而通过遗传密码子拓展技术引入的Photo-高半胱氨酸在极大地保留天然蛋白结构的同时，可通过紫外脱保护实现蛋白活性的有效调控。然而，因受到紫外光毒性的影响，Photo-高半胱氨酸的应用难以普及。

为了解决这一问题，本文中，作者创新地在高半胱氨酸的侧链上引入了PAB为核心的保护基团，设计出了HcyX。HcyX可以通过TCEP进行化学脱除，或者通过TCO基团进行生物正交脱除，避免了光毒性的问题。随后，为了通过遗传密码子拓展技术将HcyX引入到目的蛋白，研究者以GFPN149TAG为靶蛋白，进行了合成酶的筛选。由此，他们得到了具有L309A, C348A, 和Y384F突变的M. barkeri 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。后续，他们通过引入P188G突变进一步增强了该合成酶的稳定性。

通过变性凝胶电泳以及ESI-MS一级质谱的检测，研究者确定了HcyX探针成功地插入到了目的蛋白中，并且可以有效地进行保护基团的脱除，最终实现了在特定位点的高半胱氨酸的引入。随后，研究者分别在包括TEV酶，硫酯酶和Inteins等蛋白上进行了高半胱氨酸的插入与活性激活。结果显示，除了TEV酶外，其它蛋白的活性都可以有效地被HcyX抑制，并在保护基团脱除后恢复一定的活性。

综上，本文中，作者设计并构建了可通过遗传密码子扩展技术定点插入的非天然氨基酸HcyX，实现了高半胱氨酸引入的同时，还可对目的蛋白的活性进行调控。本研究对于蛋白功能的衍生化，以及蛋白工程化研究来说，具有重要的意义。

本文作者：KLH

责任编辑：LZ

DOI：10.1002/anie.202509112

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202509112