介绍的是最近在Journal of the American Chemical Society上报道的一篇标题为“Cation-Controlled Assembly, Activity, and Organization of Biomimetic DNA Receptors in Synthetic Cell Membranes” 的文章。该文的通讯作者是剑桥大学化学工程与生物技术系Lorenzo Di Michele教授和Roger Rubio-Sanchez教授。本研究开发了一种基于DNA模拟物的人工受体结构，通过G-四链体结构模拟阳离子介导的结构和功能响应，模拟多聚体膜复合物在活细胞中信号枢纽的定位。

    细胞膜是细胞用来感知和响应外界环境信号的重要组成部分，通常依赖膜受体组装为多聚复合物或发生构象变化来引发下游信号传递。其中，阳离子（如Ca²⁺、K⁺）在信号传递中扮演关键角色，通常作为信使穿梭于生物膜之间，将物理化学刺激与突触激活、细胞运动等反应联系起来。通过合成细胞科学的方法构建具有生命特征的人造细胞是近年来的研究热点，其能够复制在活体中观察到的一些复杂行为。能够为解析基础生物过程提供平台，并有望在医疗健康和生物技术领域催生颠覆性应用。对于该领域的研究而言，膜功能的设计尤为重要。

    纳米技术因其可编程性强、结构可控等特点，成为构建人工细胞仿生系统的有力工具。DNA和RNA纳米结构已被开发用于模拟细胞骨架纤维和无膜细胞器，或与脂质膜结合。同时，已经有一些两亲性DNA纳米结构被应用于合成细胞膜，以编程包括分子传感、跨膜运输、囊泡分裂等过程在内的细胞膜活动。但能够将阳离子响应性嵌入合成细胞膜等仿生系统的途径仍然十分有限，因此，难以模拟阳离子控制的受体组装、功能调控与空间定位。在DNA纳米结构中，G-四链体（G-quadruplex, G4）结构是一种由阳离子稳定的二级结构，可作为响应性模块用于构建智能膜系统。

    基于此，本文作者开发了一种基于DNA纳米结构的仿生膜受体，其结构和功能响应生理环境中的阳离子。通过将胆固醇修饰的DNA纳米结构与分子间G-四链体进行界面结合，通过筛选不同的G-四链体长度和阳离子类型来调控脂质层表面受体的形成和动态结构。并通过添加一些功能化模块，将过氧化物酶活性定位在相分离合成细胞膜的脂质域中。这一模块化平台实现了合成细胞膜结构和功能的阳离子驱动响应。

    具体而言，作者使用一种由四条56 bp的双链DNA组成的纳米结构，其一端带有六个连续鸟嘌呤（(G)₆）的悬垂序列，另一端通过双胆固醇（dC）锚定在脂质膜上。(G)₆序列可在特定阳离子条件下形成分子间的G4结构，从而实现受体的四聚化组装。在大型单层囊泡结构（LUVs）上研究受体组装特性。动态光散射结果表明，G4功能化后囊泡尺寸略有增加，表明受体成功组装，且未引起大规模聚集。Cryo-EM图像显示膜上出现电子密集区，圆二色光谱结果显示263 nm和245 nm处的特征峰，是形成了G4结构的直接证据。（图1）

图1. 膜锚定DNA 纳米装置中的鸟嘌呤重复序列通过 G-四链体形成引导阳离子稳定受体的组装。

    接下来，作者研究了G4组装结构的阳离子响应稳定性。他们设计不同长度G重复序列（(G)₄-(G)₆）的纳米结构，并用一种能选择性结合平行排列的G-四联体结构的N-甲基介孔卟啉（NMM）探针表征G4形成情况。结果表明，膜上因局部浓度升高，G4形成概率相比于溶液中显著增加，尤其是在K⁺、Ca²⁺等阳离子存在下。Li⁺和Na⁺效果较差。且膜约束导致的局部DNA浓度升高会更大程度上影响G4形成与稳定性。（图2）

图2. 膜聚集结构和阳离子环境可以控制G-四链体的形成。

    进一步地，作者研究了这种组装受体作为膜催化模拟物的能力。他们以一种基于G4链体活性的酶作为阳离子稳定受体模拟物的报告基团。将血红素辅因子堆叠在G4结构上，构成具有辣根过氧化物酶HRP活性的模拟物，将荧光前体AR催化变为荧光素。不同的设计和阳离子条件会导致血红素结合G4受体数量的不同，从而在不同条件下产生荧光产生速率的差异。通过荧光动力学曲线表征不同阳离子和G重复长度下的催化速率差异，结果显示催化速率增强倍数（k₀*）与NMM结果表征出的受体相对丰度结果呈正相关，表明催化活性与受体组装程度直接相关。（图3）

图3. 阳离子控制的DNA人工受体用于模拟膜过氧化物酶活性。

    最后，作者研究了该模拟受体在合成细胞膜域中的定位与功能。他们发现这种阳离子依赖性组装和活性可以很容易地与膜相分离耦合，从而模拟细胞膜域内多聚蛋白纳米机器的重组和活动。通过构建一种巨型单层囊泡GUVs，形成具有液态有序（L_o）与液态无序（L_d）共存的结构域。通过荧光素探针修饰DNA纳米结构，用共聚焦显微镜表征分布情况。结果表明，DNA受体在液相有序域（L_o）中富集，尤其是形成G4后。对不同阳离子环境下膜上荧光分布的分析表明，阳离子存在下，G4受体在L_o域中的分配系数（Kₚ*）显著高于无G4对照组。功能实验表明，K⁺和Ca²⁺存在时，含有受体的合成细胞膜比未功能化膜表现出更快且更高的HRP模拟物荧光转化率，能成功实现膜域内的功能定位。（图4）

图4. 阳离子依赖性组装将受体及其过氧化物酶活性定位在合成细胞膜的脂质区域内。

    综上所述，本研究成功开发了一种基于DNA的仿生膜受体平台，具备阳离子控制的组装、功能耦合和空间区域调控等特点。该平台的模块化设计与高度可编程性为合成生物学提供了强大工具，可应用于构建阳离子响应的信号通路、实现合成细胞的运动、分裂、通讯等高级功能。该研究还揭示了膜限制效应对分子组装的重要影响，为今后设计膜基纳米系统提供了理论依据。

作者：DYH  审校：ZXY

DOI: 10.1021/jacs.5c09928

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c09928