分享一篇发表在Angew上的文章。文章的题目是Activity-Based Ubiquitin Probes Capture the Sulfenylated State of Deubiquitinases。文章的作者是来自湖南大学生命医学交叉研究院的黄静教授。该课题组研究方向包括DNA损伤修复机理与基因组的稳定性、生物大分子的化学调控、靶向药物的设计及其作用机理研究等。

泛素化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，其逆转过程由去泛素化酶（DUB）催化。DUB的活性依赖于其活性中心的低pKa半胱氨酸残基，该残基对氧化还原状态敏感，是细胞氧化应激响应中的关键调控靶点。DUB催化半胱氨酸可被可逆氧化为次磺酸（─SOH），也可进一步不可逆氧化为亚磺酸（─SO₂H）或磺酸（─SO₃H）。其中，次磺酸化（DUB-SOH）作为重要中间态，可逆地抑制DUB活性，进而影响蛋白质运输、折叠、翻译及DNA修复等过程，在癌症和神经退行性疾病中具有病理意义。

为研究DUB活性及调控，基于活性的泛素探针（Ub-ABP）已成为关键工具。传统Ub-ABP（如Ub-PA）主要靶向还原态DUB，难以捕捉氧化还原调控过程。为此，本研究开发了一类新型Ub-ABP，通过在泛素C端引入次磺酸反应弹头，可在体外和细胞裂解物中选择性标记次磺酸化DUB。结合定量质谱，该工具为在生理条件下解析泛素系统的氧化还原调控机制提供了有力手段。

探针由两部分构成：泛素支架用于靶标识别，次磺酸反应弹头实现共价捕获。本研究选取了三类弹头：经典且生物相容性高的二甲酮（dimedone）、结构紧凑且反应性更强的PRD衍生物，以及通过亲电机制实现快速捕获的降冰片烯类试剂，并基于此构建了DUB-SOH靶向探针。

为评估探针反应性，作者选用对氧化敏感的去泛素化酶USP2的催化结构域USP2CD进行测试。结果显示，Biotin-Ub75-DYn-2对氧化态USP2CD标记效率最高，Biotin-Ub-PRD效果较弱，Biotin-Ub-NMA因空间位阻无标记。传统探针Biotin-Ub-PA仅有效标记还原态USP2CD，证实其难以捕获氧化态DUB。

后续作者评估了Ub73/74/75-DYn-2系列探针标记氧化USP2CD和UCHL3的能力，发现Ub74-DYn-2效率最高。分子模拟显示其弹头与催化半胱氨酸距离最近（1.8 Å），空间取向最优。竞争实验证实其对次磺酸的选择性。LC-MS/MS分析直接鉴定到Cys95上的DYn-2加合物，证实了位点特异性共价标记。

后续作者优化了H₂O₂浓度，发现100 μM时Ub74-DYn-2对USP2CD和UCHL3的标记最强，更高浓度导致过度氧化为不可逆形式，标记消失。该探针与UCHL1反应迅速，1分钟内完成标记。DTT处理可逆转100 μM H₂O₂引起的标记损失，证实其捕获可逆次磺酸化修饰；而1 mM H₂O₂导致不可逆失活。LC-MS/MS显示在适度氧化条件下，约51.9%的氧化UCHL3为次磺酸形式。在细胞裂解物中，Ub74-DYn-2能有效检测内源性氧化态UCHL3，且标记可被DUB抑制剂PR-619抑制，证明其特异性作用于催化半胱氨酸。

后续作者利用Biotin-Ub74-DYn-2对H₂O₂处理的HEK293T细胞裂解物进行蛋白质组学分析，鉴定出13种显著富集的次磺酸化DUB和4种E3连接酶，涵盖USP、OTU、UCH和MINDY等家族。其中UCHL3的次磺酸化水平最高，并通过免疫印迹得到独立验证。该探针实现了对氧化还原敏感DUB组的全蛋白质组尺度选择性检测，为研究泛素系统的氧化还原调控提供了有效工具。

作者进一步在线粒体应激模型（CCCP处理）中测试探针，发现内源性ROS也可诱导多种DUB和E3（如OTUD4和A20）发生次磺酸化，并经蛋白质组学和免疫印迹验证。结果表明，Biotin-Ub74-DYn-2不仅能捕获外源H₂O₂引起的氧化，还可检测生理性内源ROS导致的DUB次磺酸化，具备良好的生理相关性。该探针展现出在复杂系统中研究DUB氧化还原调控的强大潜力。

本文作者：THT

责任编辑：LYC

DOI：10.1002/anie.202512311

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202512311