分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Sensitive and Accurate Detection of Low-frequency Mutations via Pyrophosphorolysis-Activated Selective Amplification and MALDITOF-MS Single-Nucleotide Resolution Identification”。通讯作者是来自厦门大学化学化工学院的杨朝勇教授和福建医科大学的许醒老师，他们的主要研究方向包括分子诊断、生物传感器与液体活检技术等。

体内各种细胞正常生理性死亡后，它的DNA会被切割成短的片段并释放到血液中，这些DNA片段被称为细胞游离DNA（cfDNA）。其中有部分是由肿瘤细胞释放出来的，被称为循环肿瘤DNA（ctDNA）, 它们携带了肿瘤特有的基因变异信息。在精准医疗时代，利用cfDNA进行液体活检对癌症的早期筛查、疗效监测和预后评估至关重要。然而，这一技术的核心挑战在于，如何从海量的野生型（WT）cfDNA背景中，精准地检出极微量的ctDNA突变。现有的方法，如二代测序（NGS）和扩增阻滞突变系统定量PCR（ARMS-qPCR），在灵敏度、多重检测能力或成本方面存在局限，难以满足临床对超低频突变（如变异等位基因频率VAF < 0.1%）检测的需求。

基于此，作者创新性地开发了一个名为杂交超灵敏核酸靶向富集与读出平台（HUNTER）。HUNTER的核心技术原理在于巧妙地结合了焦磷酸解活化聚合（PAP） 的高特异性扩增与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） 的高精度检测。

首先，在靶向富集阶段，HUNTER利用了PAP技术独特的“开关”机制。 与传统ARMS-qPCR依赖聚合酶被动识别末端错配不同，PAP技术的引物在其3’末端被一个双脱氧核苷单磷酸（ddNMP）所“封闭”，使其无法直接延伸。只有当引物与突变DNA模板完全互补时，DNA聚合酶才能在焦磷酸（PPi）存在下，启动焦磷酸解反应，精确地“切除”这个末端阻断基团，从而“解锁”引物，开启后续的扩增。而对于野生型模板，由于存在末端错配，焦磷酸解反应无法发生，引物始终保持“关闭”状态。这种主动的、酶控的“解锁”机制，从源头上极大地抑制了野生型背景的扩增，实现了对低频突变的选择性富集。

随后，在信号读出阶段，HUNTER摒弃了传统的荧光检测法，采用了MALDI-TOF-MS进行直接质量检测。 经过PAP富集的产物，会进行一步单碱基延伸反应。针对每一个需要检测的突变位点，设计一条短的延伸引物。这条引物的3’端会紧贴着突变位点，但不包含突变位点本身。这条引物会特异性地退火到PAP扩增出的单链DNA模板上。该反应使用四种分子量各不相同的双脱氧核苷酸（ddNTP），使得延伸产物因所掺入碱基的不同而具有独特的分子量。MALDI-TOF-MS则能像一台精密的“分子秤”，直接读出这些产物的质量，从而实现对突变类型的单核苷酸分辨率鉴定。这种方法避免了荧光检测中常见的信号交叉和光谱重叠问题，为多重检测和高特异性分析奠定了基础。

研究结果表明，HUNTER平台展现出卓越的性能：其检测限低至0.01% VAF或3个拷贝的突变，并能在单次反应中实现10重检测，同时对临床样本的分析保持了100%的特异性。

总而言之，作者开发的HUNTER平台，通过将PAP的高特异性富集能力与MALDI-TOF-MS的精准检测能力相结合，成功地解决了液体活检中超低频突变检测的瓶颈。这一技术不仅灵敏度与特异性俱佳，而且具备多重、快速和成本低廉的优势，为癌症早期诊断、微小残留病灶监测及精准用药打开了新的局面，有望成为下一代分子诊断的有力工具。

本文作者：TZM

责任编辑：TZS

DOI：10.1021/jacs.5c08741

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c08741