应用背景

生物素标记抗体广泛用于：

• ELISA二抗：HRP-链酶亲和素检测系统，灵敏度高于直接HRP标记抗体

• 流式细胞术：生物素化一抗 + PE/APC-链酶亲和素荧光二级检测

• 免疫组化/免疫荧光：生物素信号放大（ABC法）

• Western Blot：用于Strep-HRP系统的条带检测

• SPR/BLI：固相捕获，通过SA芯片固定生物素化抗体

高质量的生物素化抗体，是以上所有实验成功的前提。

抗体生物素标记实验室操作流程

材料准备

操作步骤

Step 1 — 抗体透析/换液
将抗体换至标记缓冲液（PBS pH 7.4），去除Tris、甘氨酸等含一级胺的组分（会竞争NHS-Biotin）。

Step 2 — NHS-Biotin配制
称取NHS-Biotin，溶于无水DMSO至10~20 mmol/L（避免水解），立即使用。

Step 3 — 标记反应
按照**摩尔比（Biotin : IgG = 10:120:1）**将NHS-Biotin加入抗体溶液，25°C轻柔摇动3060 min。

摩尔比选择原则：DOL目标值 = 25（每个IgG分子上25个生物素）
摩尔比过低 → DOL不足，信号弱
摩尔比过高 → 抗体活性损失，抗原结合能力下降

Step 4 — 终止与纯化
加入Tris-HCl（pH 7.5，终浓度10 mmol/L）终止反应，室温孵育5 min。
随后用脱盐柱（Zeba G-25）去除游离生物素，换液至PBS。

Step 5 — 质量检测

质量控制关键指标

①DOL（标记度）检测 — HABA比色法

原理：HABA与链酶亲和素结合呈橙色（A₅₀₀=0.9），生物素化抗体中的生物素置换HABA，A₅₀₀下降。

计算公式：
DOL = (ΔA₅₀₀ × 34500) / (A₂₈₀ × 147000 × ε)

目标范围：DOL = 2~5（最优3左右）

②抗体活性验证
用未标记抗体作对照，通过ELISA验证生物素化抗体的抗原结合活性保留率 ≥ 80%。

③聚集体检测
SEC-HPLC确认标记后抗体无明显聚集（单体比例 ≥ 90%）。

失败原因与解决方案

纳孚生物提供外包标记服务

如果实验室没有合适的设备或时间自行标记，纳孚生物提供抗体外包生物素标记服务：

• 客户提供抗体样品（最低0.5 mg）

• 纳孚生物完成标记、纯化、DOL检测全流程

• 附HABA检测报告 + 活性验证（可选）

• 5~7个工作日交付，冻干粉或溶液形式均可

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纳孚生物 — 专业化合物定制合成与生物素标记服务商