▲第一作者： 吕士德，韩孝新;通讯作者：陈建宾教授
通讯单位：齐鲁工业大学
论文DOI：10.1002/anie.202001510
本文中，报道了一种环境友好的电化学方法，其利用“推拉效应”和“离域作用”产生氮中心自由基（NCR）。通过改变电极材料的反应参数和原料溶解度，脱芳香化使得选择性脱氢C-N与N-N键形成反应成为可能。另外，我们还着重的挑选出一批化合物去研究它的生物活性和光化学性质。
含氮化合物作为与生物相关的化合物、药物、和天然产物中的关键结构组成而备受关注。为了合成出此类化合物，许多课题组已经付出了巨大的努力，特别是通过过渡金属催化的交叉偶联或脱氢胺化方式。2010年，Zhu 课题组报道了铜（II）助催化的直接分子内C-H胺化的反应。该反应在氧气的气氛下，130摄氏度下进行，反应使用醋酸铜作为催化剂，九水合硝酸铁作为氧化剂，N,N-二甲基甲酰胺作为反应溶剂实现了分子内的胺化反应（J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 13217-13219.）；2018年，Stahl 和他的同事开发了一种咔唑和二芳基胺的有氧氧化二聚反应，反应是在以CuBr• Me2S和4-二甲基氨基吡啶作为催化剂，二氯乙烷作为反应溶剂，氧气的条件下进行的，反应17个小时后得的偶联产物（J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 9074-9077.）。在过去的十年中，电化学有机合成已被公认为是可以满足社会发展与环境兼容的过程所需的几个重要标准的方法之一。它可以用来代替有毒或危险的氧化或还原试剂，减少能耗。用电子替代了化学计量的氧化还原试剂，这种绿色方法有助于最大程度地提高原子效率，并减少废物流中的有毒试剂（例如重金属）。这些只是使电化学对环境有用的一些最重要的属性。在有机合成中，尽管尚未充分利用电子转移驱动的反应的潜力，但已广泛用于各种转化。在电子转移驱动反应的几种方法中，电化学方法是一种简单而有效的方法。吡啶并[1,2-a]苯并咪唑是一类重要的杂环化合物，它们具有多种生物活性，例如抗疟疾，抗真菌，抗肿瘤和抗病毒，以及在荧光和染料中的应用。 因此，人们对它们的构造给予了极大的关注。此外，四芳基肼是天然产物双氧霉素A和B中的独特结构骨架（Eur. J. Org. Chem. 2012, 2012, 5256-5262），还可用作电催化剂（Angew. Chem.Int. Ed. 2018, 57, 1636-1639）。仲胺与氧化剂的常规过渡金属催化氧化偶联是制备它们的主要步骤。鉴于这类结构的用处以及我们对有机电化学的兴趣，我们设想通过控制电化学中的关键因素之一，即电流密度，以可调的方式提供独特的目标化合物，我们的设想基于以下原理：电流密度与电极表面的反应速率成正比，因此与反应性中间物质的浓度相关，这也是本文的核心之处。在合成吡啶并[1,2-a]苯并咪唑类化合物时，我们尽量将反应过程中的电流密度降低，以获得低浓度的氮中心自由基，来尽可能使每一个氮中心自由基都能被自身化合物分子捕获进而实现C-N键的生成。至于低的电流密度我们是通过使用具有较大比表面积的石墨棒来实现的；与之相比的是我们在合成四芳基肼类化合物时，为了使反应过程中氮自由基的浓度足够高，我们将电流密度扩大了上万倍，在铂电极作分别作为电解过程中的阴极与阳极的条件下，我们以5毫安的恒定电流实现了该类化合物的合成。
在上述的条件下我们分别成功的合成了30个以上的C-N偶联化合物和N-N偶联化合物：为了深入的了解反应机理，我们进行了许多对照实验（Figure 1）和循环伏安分析（CV，Figure 2）。甲基取代的胺的电解几乎没有产物（Eq.1）。 该观察结果突出了游离N-H部分的重要性。重要的是，通过核磁共振（NMR，Figure S6）和CV结果（绿线与粉红线，Figure 2a）验证了强碱（即氢氧化物）对底物N-H的去质子化作用。显然，氮阴离子的氧化峰电位（绿线，Ep = 0.44 V vs SCE）明显低于相应起始原料的氧化峰电位（粉红线，Ep = 1.22 V vs SCE，Figure 2a）。在标准条件A或B中添加自由基清除剂，例如2,2,6,6-叔甲基-1-哌啶基氧基（TEMPO）或丁基化羟基甲苯（BHT），均会导致明显的抑制作用（Eq. 2 and 4）。显着地，当存在相等摩尔的物质时，交叉偶联产物与其他两个均相偶联产物以大约1∶1∶1的比率生成。一般而言，人们认为自由基反应是非选择性的并且不能被控制。因此，非常需要自由基的选择性交叉偶联。非常有趣的是，在标准条件B下，只需添加5当量的一种物质（Eq. 5），即可显着改善交叉偶联化合物。综上所述，这些数据充分证实了以氮为中心的自由基中间体参与了该过程。值得注意的是，在条件A下测量了逆动力学动力学同位素效应（KIE = 0.89）（Eq. 3）。数据与碳中心从sp2到sp3的构型变化一致，证明胺化步骤中不涉及C-H键裂解。然后，我们通过CV研究了化合物1、2和3的电化学行为。有趣的是，观察到化合物3的可逆循环伏安图，而化合物1检测到完全不可逆的结果。然而，在潜在的潜在窗口中几乎没有观察到化合物2的氧化峰（Figure 2b）。▲Figure 1. Control experiments.
▲Figure S6. 1H NMR spectra of N-phenylpyridin-2-amine with/without TBAOH (1 equiv.)
▲Figure 2. CV analysis. Substrate (0.01 mol/L), LiClO4 (0.1 mol/L), GC as the working electrode, Pt wire as counter electrode, SCE as reference electrode, scan rate: 100 mV/s. a) in MeCN/MeOH (14:1); b) in MeCN.
在初步机理研究的基础上，提出了如Scheme 3中所列的假定反应途径，文章中有详细介绍，这里不做赘述。▲Scheme 3 Putative mechanism.
首先，测试了对人类癌细胞的抗菌活性和细胞毒性。 几种化合物显示出高活性。 例如，化合物15、34和12可分别抑制金黄色葡萄球菌，酿酒酵母和宫颈腺癌HeLa细胞的生长55％，49％和44％。 同时，化合物8和29可以抑制肝癌细胞HepG2超过42％。 此外，化合物8还可以将黑素瘤细胞系A375抑制53％。
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| Staphylococcus aureus ATCC-6538 |
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| hepatocarcinoma cell line HepG2 |
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| cervix adenocarcinoma HeLa cells |
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其次，化合物21在不同浓度下均具有较大的斯托克斯位移（约130 nm），具有很强的荧光增强作用，可潜在地应用于亚细胞成像（Figure 3）。 吗啉被视为溶酶体的靶向基团，因此增加了化合物21在溶酶体中的分布。 为了研究亚细胞定位能力，将具有商业溶酶体示踪剂LysoTracker red的化合物21应用于HeLa细胞。 如Figure 4所示，来自绿色通道的荧光信号与LysoTracker Red的荧光信号叠加得很好。 此外，绿色通道和红色通道的荧光强度与高重叠Pearson系数为0.80和Mander重叠系数为0.81高度相关。 因此，化合物21位于活细胞中的溶酶体中。▲Figure 3. UV-vis. absorption specta and fluorescence emission spectra of compound 21 in DMF.
▲Figure 4. Brightfield and fluorescence images of HeLa cells stained with compound 21 (10 μM) and LysoTracker Red. a) brightfield image, b) with 21, c) from the red channel (lysosomes staining), d) overlay of brighfield, green and red channels, e) intensity profile of linear region of interest across in the HeLa cell costained with LysoTracker Red and 21.
总而言之，基于“推拉效应”和“离域作用”，从易得的原料中阐述了一种电化学可调控的方法，提供了容易获得的分子间N-N偶联和分子内C-N偶联的方法。通过改变包括阳极材料和溶剂种类等反应参数，可以实现氮自由基浓度的调控。通常，高浓度的氮自由基有利于自由基N-N偶联途径，而低浓度的氮自由基将被进一步氧化为正式的脱芳香化2e氧化产物。该方法的可扩展性，无过渡金属和无外源氧化还原剂的特性突出了新开发的有机电解的绿色性和可持续性。生物学评估证明了我们产品的潜在应用，包括抗菌和抗肿瘤活性。光化学性质表明，化合物21适用于具有较大斯托克斯位移（约130 nm）的细胞标记；此外，在活细胞中很好地实现了溶酶体荧光成像。基于这些优点，新开发的方法代表了多样化合成的理想策略，并且可能在化学，生物医学和材料科学中得到利用。陈建宾教授，2015年11月以“优等生”提前1年获得德国莱布尼茨催化研究所驻罗斯托克大学（LIKAT）博士学位，2016年3月赴美国加州大学伯克利分校开展博士后研究，2017年4月加入齐鲁工业大学开展独立科研工作。入职三年来，主持国家自然科学基金、省自然科学基金和厅局级项目5项；以唯一通讯发表SCI一区文章7篇。目前主要从事光/电催化，生物质转化，金属有机化学，药物合成和功能材料等方面的研究工作。
周建华教授：1999年获山东大学博士学位，现为齐鲁工业大学化学与制药工程学院教授。主要研究领域为分子反应动力学的理论计算研究。张国锋博士：2018年获南开大学博士学位，主要研究领域为无机功能材料的晶体生长与纳米材料的新合成方法、纳米材料自组装及纳米结构的新构筑途径、无机功能材料在光电磁及能源方面的应用。
马丽博士：2019获北京理工大学博士学位，目前主要从事有机多孔材料，光、电催化有机反应以及生物质转化等方面的研究。
李宝迎博士：2019年获中国地质大学博士学位，目前主要从事光催化降解反应，电催化氧还原反应，光电催化分解水产氢和产氧等方面的研究。
牛立伟博士：2019年获中国科学院大学（中国科学院山西煤炭化学研究所）博士学位，研究领域为：
1. 碳基能源转化：包括CO、CO2、CH4的催化转化，生物质催化转化；3. 纳米材料、碳基功能材料和单原子等材料设计：从纳米颗粒、原子簇到单原子尺度理解催化反应机理，并进行催化剂的理性设计；4. 原位动态谱学表征技术，利用第一性原理研究催化反应机理。刘思远博士：2019年获大连理工大学博士学位，现研究方向为：电催化有机反应、有机合成方法学、化学生物学。
