今天给大家分享一篇近期发表在Macromolecules上的研究，题为：Multiblock Copolymers toward Segmentation-Driven Morphological Transition。文章的通讯作者是四川大学的丁明明教授、谭鸿教授和傅强教授。
传统的理念认为，嵌段共聚物在水溶液中的自组装行为是由亲水和疏水的体积分数决定的（图1a），由此，人们开发了许多能够根据pH、温度等刺激来改变形貌的自组装体系。但这些体系的形态变化主要来自共聚物亲疏水平衡的变化，化学可调性低；大多数体系都基于简单的AB二嵌段或ABA三嵌段共聚物，结构多样性有限。自然界中某些蛋白的活性基于多个疏水和亲水链段的相分离结构，受此启发，多嵌段共聚物（multiblock copolymers，MBCs）的相分离结构也有调控自组装的能力，作者提出了一种全新方法，链段驱动自组装（segmentation-mediated self-assembly，SMSA），巧妙通过简单地改变MBCs的嵌段数目，在保持两亲性不变的情况下诱导自组装形态的转变（图1b），体系由无毒原料通过简便的一锅法得到，同时富含二硫键的中间层赋予了体系类蛋白的结构和氧化还原响应性（图1b），从而能实现药物高效控释。该体系在药物递送、仿生材料等方面有很好的应用前景，工作中实验和计算的分析有助于对大分子组装的理解。
图1. 嵌段聚合物自组装调控
为得到嵌段数不同的MBCs样品，作者用半胱氨酸甲酯合成了一种含二硫键的新型CDI（图2），以甲氧基聚乙二醇为端基与己内酯通过开环聚合得到了二嵌段共聚物P1，P2-P4则由CDI连接PCL和PEG得到，P1-P4的嵌段数目依次增多，分别为2、4、10、20（图3）。
图2. 半胱氨酸衍生CDI的合成
图3. 样品P1-P4的相关数据
为了研究形态的变化，作者用不同形态的MBCs来包载亲水的罗丹明6G（R6G），由此可通过荧光来对粒子形态进行定性分析，与溶解在相同浓度水中的自由R6G相比，掺入P4后的R6G荧光强度和寿命显著降低，P4的封装效应导致了染料的聚集从而提高了浓度加速了自猝灭。透射电子显微镜（TEM）成像为不同组装结构的形成提供了直观的证据，图4中的结构能观察到分散良好的胶束、蠕虫链和多聚体。
图4. 各样品TEM成像图
传统的胶束-囊泡转变通常是通过增加疏水和亲水的体积比来实现的，作者提出的新方法中只需要增加共聚物的共聚片段数，在保持两亲性比例不变的情况下驱动形态转变（即链段驱动自组装，SMSA），作者猜测MBCs独特的自组装行为与多个疏水和亲水结构域之间的相互作用有关。为了验证这一假设，作者对样品进行了1H-1H NOESY测量，可以看到P4（图5d）的光谱中PCL和PEG片段之间相关性很大，而在P2（图5c）的光谱中这种相关性减弱了，表明多嵌段数多的共聚物中存在更强的PCL/PEG相互作用。
图5. 1H-1H NOESY谱图
为了理解链段序列对形态转变的影响，作者合成了一种具有不同链段排列的共聚物P4-D，P4-D中有富含PCL的区域和富含PEG的区域，序列的控制由降解酶和GPC测量得到验证，脂肪酶选择性地分解PCL组分，然后检测PEG残基与PEG单体的分子量。P4的PEG残基与单体分子量相近，表明大部分PEG链段都被PCL分隔；P4-D残基的分子量几乎是PEG单体的几倍，这代表着P4-D中确实存在富含PEG的区域。通过DLS、SLS、TEM和荧光模拟表明，P4-D的自组装表现为球形胶束，而不是P4那样的囊泡形态，这表明疏水性和亲水性交替的多嵌段结构对形态转变起着主导作用。
考虑到聚合结构中半胱氨酸残基和氨基甲酸乙酯键的参与，体系中有可能出现氢键或二级结构。为了验证这种可能，作者测定了样品聚合物薄膜在平板上和样品D2O溶液中的红外光谱，发现样品中氮氢键和碳氧键的拉伸带并无明显差异，在尿素存在下，NR-loaded的MBC纳米载体荧光强度非常弱，从而排除了氢键对形态变化的影响，巩固了多嵌段结构对形态的主导作用。
作者进一步评估了CDI残基是否与SMSA有关，因为CDI中的二硫键能确实有可能影响自组装。作者用市售的赖氨酸乙酯二异氰酸酯（LDI）作为偶联剂代替CDI合成了对照组P4-L，P4-L也具有交替的链段结构，但不含CDI中的二硫键，结果表明P4-L也呈现预期中的囊泡状，再次证明了SMSA的主导性。
考虑到体系中的CDI有氧化还原响应性，作者设想MBCs的解聚是否能够诱导形态的逆转化（polymerization-induced morphology reversion，DIPMR），为了验证这一假设，作者用10 mM的GSH处理聚合物组装体并检测其大小变化，不含二硫键的P1尺寸几乎不变，P2由于聚合物胶束的断裂和聚集尺寸逐渐增大，P3和P4的尺寸减小，在还原剂加入后样品会引发形态转变，P4的形态从囊泡结构转变到蠕虫和胶束结构，P3的形态从蠕虫结构转变到胶束结构，这些结论再次为片段介导的自组装行为提供了证据。作者设想这种富含二硫键的中间层能够经过还原剂实现荷载的有效释放，为了验证这一功能，作者在P2-P4自组装体中负载了尼罗红NR并用细胞内浓度的GSH处理。如预期中那样，NR释放速度很快，随着链段数目的增多NR的释放速率进一步加快（图6）。随后作者用阿霉素（DOX）作为药物模型，评价其控释性能。所有的纳米载体都有效装载了DOX，并且在10 mM GSH的反应中显示出嵌段数目依赖的快速释放。为了证明MBCs的高响应性来源于其富含胱氨酸结构，作者用GSH处理不含二硫键的P4-L作为对照。结果表明P4-L的粒径没有变化，NR的释放很少，说明P4-L对GSH并不敏感，响应性来自于富含二硫键的中间层。
图6. 负载NR的P2-P4氧化还原响应性实验
MBCs的特异性和超高速药物释放对靶向治疗尤其有吸引力，为了评估细胞内的药物传递，作者将MCF-7乳腺癌细胞与装载DOX的纳米粒子培养，并用流式细胞仪进行分析，如预期中一致，肿瘤细胞中的DOX荧光强度和时间随着聚合物嵌段数的增加而增加（图7a）。通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察培育4h后的DOX细胞内分布，从图6b和6c中可以看出，嵌段数少的样品DOX主要分布在细胞质中，嵌段数多的样品DOX主要分布在细胞核中，这种变化可能来自于细胞内GSH对引发的DOX快速释放，游离药物进入细胞核。为了确认粒子形态是否对细胞内DOX的传递有影响，细胞被丁硫氨酸-亚砜亚胺（BOS，一种GSH生物合成的抑制剂）预处理后，观察到细胞进入率随着嵌段数增加而增加。此外DOX负载的MBC纳米颗粒主要分布在经BSO处理的细胞的细胞质中，而不在细胞核中，这一结果表明组装结构和氧化还原引发的药物释放都有助于细胞内药物的高效传递。
图7. 负载DOX的MBCs药物释放及亚细胞分布实验
有效进入细胞核的DOX能干扰DNA复制并杀死肿瘤细胞，为了测试这种潜力，作者使用MTT法评估了DOX负载药物的治疗效果。研究发现，聚合物制剂的细胞毒性低于游离药物，这是因为MBCs与游离药物有更低的细胞吸收率。此外，半抑制浓度（IC50）随着共聚物嵌段数的增加而降低，表明MBCs具有更大的有效药物传递潜力。另一方面，该体系是由FDA批准的PCL、PEG和无毒氨基酸衍生物组成，具有天然的生物相容性，可作为生物材料使用，无药物的组装体对L929成纤维细胞没有任何负面影响，但还需要进一步的体内实验。
总而言之，作者制备了一系列嵌段数不同、序列不同、连接基团不同的生物可降解响应性MBCs，多嵌段的结构能促使自组装体系从胶束到蠕虫状和囊泡形态的转化，而半胱氨酸衍生物的linker能诱导体系发生形态的逆转化，具有类蛋白结构和氧化还原响应性的组装体在GSH存在下表现出有效荷载和超快释放，从而改善药物的亚细胞分布提高治疗效果，该工作为大分子自组装调控提供了新视角，对纳米材料的结构功能调控有指导意义。
作者：WG 审校：WH
DOI: 10.1021/acs.macromol.0c00374
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.0c00374
