今天给大家分享一篇最近发表在Chem.Commun上的研究进展，题为：Protein-recruiting synthetic molecules targeting the Golgi surface. 文章的通讯作者是名古屋工业大学的Shinya Tsukiji教授。
具有细胞器定位功能的小分子配体在控制活细胞中蛋白质定位和信号传导过程中具有十分实用的价值。通过将这种类型的小分子配体与可结合细胞器或亚细胞位点的人工合成的定位序列相连接，制备得到自定位配体（self-localizing ligands, SLs）（图1）。如此一来，SL可以结合其靶蛋白并将其从细胞质中募集到靶细胞器中。因此，这种SL诱导的蛋白易位（SLIPT）方法学可以开发出各种具有蛋白质募集功能的化合物（或潜在药物），这些化合物可以以细胞器特异性方式对信号分子进行快速控制。
然而，由于人工合成的定位序列的可用性有限，SLIPT方法在细胞生物学中的使用仅限于在质膜（PM）或内膜（ER/Golgi膜）上的有活性的蛋白质。因此，扩大适用于小分子定位的细胞器特异性合成序列库是一件十分有意义的挑战。在这里，作者报道了一种新型高尔基体特异性定位序列并将其用于控制高尔基体表面信号分子。
图1. SLIPT系统的示意图。N-甲基化的mgcTMP配体被用作自定位配体（SL），以控制高尔基体靶向的eDHFR-融合蛋白的募集。
作者在先前的研究中，开发了一种靶向质膜的自定位配体，称为mgcTMP（图2），其中甲氧苄啶（TMP）是二氢叶酸还原酶（eDHFR）的小分子配体，通过柔性连接子与肉豆蔻酰甘氨酸—半胱氨酸（myristoyl-Gly-Cys, myrGC）脂肽偶联。该脂肽可定位于质膜和部分高尔基体。mgcTMP已被证实可以诱导哺乳动物细胞中eDHFR融合蛋白从细胞质快速转移到质膜和高尔基体。但是，后来发现myrGC序列会被细胞中的蛋白酶水解切割，mgcTMP诱导的蛋白易位仅暂时存在（小于1 h）。为了解决这个问题，作者开发了一种抗蛋白水解的自定位配体 mDcTMP，通过使用由肉豆蔻酸和D-半胱氨酸组成的序列，可以实现持续的蛋白质易位（图2）。
图2. 本研究中使用的自定位配体（SL）的化学结构。 N-甲基以黄色突出显示。
酰胺键的N-甲基化被广泛用于赋予对肽的蛋白水解抗性。因此，作者采用N-甲基化策略并合成了三个新化合物-编号1（mgc1MeTMP），编号2（mgc2MeTMP）和编号3（mgc3MeTMP）其中，一个，两个和三个N-甲基被引入到mgcTMP 的myrGC序列中。作者使用表达eDHFR融合的EGFP（eDHFREGFP）的HeLa细胞的SL诱导的蛋白易位（SLIPT）方法学分析测试了这些化合物对蛋白易位效果进行评估（图3）。
图3. 耐蛋白水解的靶向高尔基体的自定位配体SL的蛋白易位效果。
作者指出肉豆蔻酰-LCys连接的TMP（mcTMP），即mgcTMP去除甘氨酸，其效果与mgcTMP相似，并且也仅能诱导瞬时蛋白易位。同样地，作者通过两个酰胺基团的N-甲基化将mcTMP转化为耐蛋白水解的自定位配体（mc2MeTMP，编号4，图2）
为了量化SL的高尔基体靶向特异性，作者评估了eDHFR-EGFP易位后细胞的高尔基体与质膜荧光强度的比率（G/P比）。 随着mgcTMP中N-甲基化位点的增加，G/P比值显着增加，从而确定mgc3MeTMP是高尔基体特异性最高的SL。
在后续的实验中，基于mgc3MeTMP的SLIPT系统可用于高尔基体Ras的合成激活和高尔基体PI4P的耗竭（图4），使其成为化学和合成生物学中用于研究和操纵活细胞中在高尔基体表面发生的生物过程的重要手段之一。
图4. 高尔基体Ras的激活示意图。加入mgc3MeTMP后，使用mCherry-eDHFR-RasGRF1cdc25（RD-RasGEF）激活高尔基体Ras（EGFP-NRas）。 Ras的活性由带有mTagBFP2标签，Ras结合域的cRaf（BFP-RBD）来检测。
总的来说，作者提出了专门定位于高尔基体表面的合成配体。配体可以将它们的靶蛋白从细胞质迅速募集到高尔基体，并被用于操纵高尔基体膜上的信号蛋白和脂质，为研究和控制高尔基体/细胞功能提供了一种新的有用的化学工具。
作者：WH 审校：HYL
DOI: 10.1039/d0cc06908f
Link: https://doi.org/10.1039/D0CC06908F
