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Angew. Chem. Int. Ed. | 多酶蛋白质笼组装体的级联反应

推荐发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的“Organizing enzymes on self-Assembled protein cages for cascade reactions”。本文的通讯作者是来自大连理工大学薛闯教授与肯尼索州立大学李博教授。


    自组装生物材料指一类通过非共价相互作用结合、具有明确的多级结构的新兴材料。由于其具有丰富功能和可修饰性,它们在材料科学、生物工程和医学中具有广泛的应用。它们广泛存在于活细胞,如膜结合细胞器、多酶复合物、蛋白质结合微室等具膜细胞器,其内部存在空间上有序排列的酶,提高生化反应速率,控制代谢节点处的代谢通量。
    研究者们试图通过自组装聚合物胶束、脂质体等合成高分子组装体模拟活细胞中的细胞器。然而,它们通常具有异质性,难以实现尺寸、形状的控制,而且它们无法在细胞内部表达,难以在胞内发挥作用。此外,核酸、合成多肽和固有无序蛋白(intrinsically disordered regions, IDRs)等生物大分子也被用于构建细胞器模拟物,但它们都有着各自的局限性,如基于DNA/RNA的组装体成本过于高昂。它们还容易在复杂的胞内环境中解散,从而限制了在活细胞中的应用。
    蛋白质笼(protein cages)是由一个(或几个)蛋白质亚基的多个拷贝组成的自组装超分子蛋白质纳米结构,它们具有均一尺寸以及固定构型,同时还具有多个锚定位点、化学/遗传学可修饰性以及出色的生物相容性,是更为理想的生物纳米平台。该新兴领域的研究热点集中于生物医学应用,如基因治疗和疫苗。仅有少量文献报道了蛋白质笼作为“微型反应容器”,而且这些研究工作大部分在体外进行。本文中,作者利用球状蛋白质笼Mi3作为支架,在体外和胞内结合多种参与级联反应(多步串联反应)的酶,从而增强生物合成效率,同时研究酶之间距离、酶动力学对级联反应整体速率的影响。
    如图1(a)所示,本文作者选用的蛋白质笼是Mi3,它是一种基于嗜热细菌醛缩酶的十二面体蛋白笼,由26个直径为60 nm的相同亚基组成。如图1(b)所示,本文主要研究的级联(酶催化)反应为2-琥珀酰基-6-羟基-24-环己二烯-1-羧酸酯(2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate, SHCHC)生物合成反应,涉及三种不同的酶,分别是MenFMenD  MenH。通过Mi3中融合表达SpyCatcher(SC)、三种生物合成酶中融合表达SpyTag(ST),作者得到SCMi3STMenFSTMenD  STMenH,使得三种酶能结合在Mi3表面形成稳定组装体(SCST之间具有特异性结合能力)DLSTEM等表明组装前后蛋白质笼均是单分散的。如图1(d)(e)所示,多酶组装体的体外催化性能显著优于“游离”酶催化体系,而且前者催化速率随组装体中酶密度提高而提高。值得注意的是,催化速率的提高不仅源于酶之间距离的减少,缩短中间产物扩散时间,而且酶本身的催化效率(MenH)也会在组装后提升。
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1. (a) 多酶组装体示意图;(b) 本文涉及级联反应,MenFMenD  MenH是该反应涉及三种酶;(c) 组装前后,负染色透射电子显微镜图像;(d) “游离酶催化体系与多酶组装体催化速率比较;(e) 不同结合密度的多酶组装体催化速率比较;(f) 组装后,MenH表现出增强的酶动力学。
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2. (a) 用于番茄红素生物合成的工程菌株的遗传构建;(b) 多酶组装体(Ely1)和无组装体(Ely0)的生物合成示意图;(c) 两种工程菌株之间的番茄红素合成速率差别。

    接着,作者验证了该策略在活细胞内同样适用。作者选择了番茄红素生物合成作为待研究的级联反应,该过程中涉及多种酶和重要中间产物(如图2(a)Ely0)。如图2(a)所示,作者构建了两种质粒,Ely1中具有SCMi3AtoBSTHMGSSTHMGRST的基因,而Ely0中具有SCMi3AtoBHMGSHMGR的基因。因此,含有前者的菌株内部能产生多酶组装体,而后者无法产生。如图2(c)所示,Ely1的番茄红素合成速率明显高于Ely0,增加了约8.5倍。
    综上所述,本文作者开发了一种基于球状蛋白质Mi3的多酶组装体构建策略,它能在体外和胞内形成结构稳定、单分散的纳米组装体。如果这些酶参与同一级联反应,那么该级联反应的速率将大幅提升。作者利用体外SHCHC的生物合成以及胞内番茄红素的生物合成证明该策略的合理性。

作者:LXY  审校:HYH
DOI: 10.1002/anie.202214001
Link: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202214001

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