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黄精炮制二氯甲烷组分Maillard反应产物及抗氧化活性研究

黄精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黄精PsibiricumRed. 或多花黄精Pcyrtonema Hua的干燥根茎。具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效[1]。黄精主要成分有多糖、甾体皂苷、蒽醌、黄酮及氨基酸类等。以其炮制品酒黄精用于临床,通过炮制以消除其麻味,减轻对咽喉的刺激,并增强补脾润肺、益肾作用[2]。黄精采用蒸法炮制,药材本身含有大量的糖类和氨基酸类成分,笔者在前期研究中,在酒黄精薄层色谱中检识到Maillard反应标志性产物5-羟甲基[3],提示黄精炮制过程可能发生Maillard反应。

Maillard反应是指氨基化合物和羰基化合物之间发生的非酶促反应[4],反应过程非常复杂,会产生不同结构的小分子和大分子的Maillard反应产物(MRPs[5]。反应伴随物理化学特征如颜色变化[6]pH值降低[7]。反应体系颜色的变化常采用UV-vis法分析,通过280 nm吸光度值表征产物特征[8-9]。随着MRPs的生成反应体系酸度降低,因此pH检测也是确定Maillard反应发生的重要指标。GC-MS法是最常用的分析MRPs小分子化合物的方法[10]。研究表明,MRPs具有抗氧化活性,通常使用比色法检测MRPs1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率,以表征其抗氧化活性[11]

目前《中国药典》2015年版中黄精和酒黄精均采用苯酚硫酸法测定多糖含量作为质量控制指标,特异性不足。同时,黄精炮制缺乏规范性,全国各地黄精炮制时间不等[12-14]。本实验从黄精酒炙过程中Maillard反应物理化学特征、小分子MRPs以及抗氧化活性角度,确定黄精酒炙发生Maillard反应,并对反应产物和抗氧化活性随炮制过程的变化进行分析,寻找黄精与酒黄精差异性成分,以期为黄精与酒黄精质量评价方法和炮制规范提供基础。

1  仪器与材料

Agilent 8453紫外可见分光光度计,美国Agilent公司;GC-MS-QP2010型气相-质谱联用仪,日本岛津公司;Rxi-5ms石英毛细管柱(30 m×0.25 mm0.25 μm),美国Restek公司;3520型便携式酸度计,英国Jenway公司;FW-80微型高速万能试样粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;TCQ-250超声波清洗器,北京医疗设备二厂;CP225D电子天平,220 g/0.01 mg,德国Sartorius公司;超纯水系统,美国Thermo Scientific公司。

C8C20正构烷烃混合标准品购自美国Sigma公司,批号1443129;氦气购自北京兆格气体科技有限公司;二氯甲烷,分析纯。绍兴黄酒,瓜渚湖黄酒,绍兴县第三酒厂,2010.11.20生产;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),美国Sigma公司;还原型谷胱甘肽(批号140706-200702,质量分数为98.9%)对照品为含量测定用,购自中国食品药品检定研究院;其他试剂均为分析纯。3个品种的黄精鲜品均采自贵州省黔西南布依族苗族自治州兴仁县,经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定,分别为百合科植物滇黄精Polygonatum kingiaum Coll. et Hemsl.、黄精P. sibiricumRed. 和多花黄精P. cyrtonemaHua的根茎,晒干。

2  方法与结果

2.1  炮制品制备[1]

黄精除去杂质,洗净,略润,切厚片(24 mm),烘箱50 ℃吹风干燥,即得。

酒黄精为取上述黄精饮片,加黄酒(100 kg黄精用黄酒20 kg),拌匀,闷润过夜至酒吸尽,置适宜容器内,隔水加热,分别炖至不同时间取出,干燥,即得。

2.2  供试品溶液的制备

取各供试品粉末(过60目筛)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入二氯甲烷100 mL,称定质量,30 ℃以下超声处理(功率250 W,频率30 kHz30 min,放冷,再称定质量,用二氯甲烷补足减失的质量,摇匀,滤过,得到二氯甲烷组分。根据各项分析需要,适当稀释或浓缩。

2.3  紫外-可见光吸光度测定

2.3.1  黄精吸光度随炮制不同时间的变化  以多花黄精为研究对象,对不同炮制时间黄精二氯甲烷组分的紫外吸收光谱变化进行研究。取供试品溶液,以溶剂为空白,在紫外区200400 nm扫描,最大吸收波长280 nm处测吸光度(A280)值结果见表1。结果显示,多花黄精二氯甲烷组分A280随炮制时间的延长而增加。

2.3.2  不同品种黄精A值变化  全国各地黄精炮制时间为1224 h[12-14],因此对《中国药典》2015年版收载3个品种滇黄精、黄精及多花黄精炮制相同时间(16 h),得到不同品种酒黄精,测定二氯甲烷组分A280,结果见表2。结果显示,《中国药典》2015年版收载的3个品种黄精经炮制16 h后,A280都增加,显示Maillard反应特征,但各品种增加的幅度不同。来源于滇黄精、黄精和多花黄精的黄精,炮制16 h得到的酒黄精A280分别是生品的1.615.72.7倍。显示各品种黄精存在一定的成分差异。

2.4  pH值变化

2.4.1  黄精炮制不同时间二氯甲烷组分pH值变化  采用酸度计测定不同炮制时间多花黄精二氯甲烷组分pH值,精确至±0.01,结果见图1。随着炮制时间的延长,多花黄精二氯甲烷组分pH值呈降低的趋势,由生品的4.66,降至16 h时最低的3.43,随后变化缓慢。

2.4.2  不同品种黄精炮制相同时间后二氯甲烷组分pH值变化  以来源于滇黄精、黄精及多花黄精的样品为研究对象,对这3个品种黄精炮制相同时间(16h)酒黄精二氯甲烷组分的pH值变化进行了研究。表3显示,3个品种黄精炮制16 h得到的酒黄精,二氯甲烷组分pH值与生品比较都呈现酸性变化趋势。但各品种变化程度不同,多花黄精变化幅度最大,显示品种之间存在成分差异。

2.5  GC-MS法分析黄精小分子MRPs

2.5.1  GC-MS色谱条件

1气相色谱条件:Restek Rxi-5ms石英毛细管柱(30 m×0.25 mm0.25 μm);进样口温度为220 ℃;程序升温:起始温度为41 ℃,以10 /min升至160 ℃,保留1 min,再以/min升至250 ℃,保留2 min,再以/min升至300 ℃,再保留8 min;进样量为4 μL,分流比为120,载气为氦气。

2质谱条件:电离方式为EI,离子源温度200 ℃,接口温度为220 ℃,电子能量70 eV,电离电压1 760 V,质量扫描范围m/z45550。按上述气相及质谱条件对供试品分析,得其总离子流图,见图2

2.5.2  GC-MS分析 对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到各组分的质谱图,经过质谱计算机数据检索系统(质谱数据库NIST05.LIBNIST05s. LIBNIST08.LIBNIST08s.LIBWiley9.LIB)仅计算匹配度大于80%的鉴定结果,同时参考C8C20正构烷烃混合标准品在此实验条件下的保留指数(retentionindexRI[15],用峰面积归一化法计算样品中各组分的相对质量分数,从而确定黄精和不同炮制时间酒黄精中的化学成分以及各化学成分相对质量分数。从黄精与48162432 h酒黄精中,分别鉴定出151718182522个化合物。这些化合物为杂环类、酸类、酯类、烷烃类、醇类、酮类和烯烃类等。黄精与不同炮制时间酒黄精共同含有12个化合物。5个不同炮制时间酒黄精共新产生了15个化合物(表4),其中48162432 h酒黄精分别有5661310个。依据成分含量随炮制时间的变化趋势可分为3类:第1类成分随着炮制时间的延长含量呈现增加趋势的化合物有4个,包括正己酸、3-羟基二氢-2(3H)-呋喃酮、4-羟基二氢-2(3H)-呋喃酮和5-羟甲基糠醛;第2类成分先升高后下降的化合物为3,5-二羟基-6-甲基-2,3-二氢-4H-吡喃-4-酮、4-甲基-2,6-二叔丁基苯酚和2-乙基己基草酸己酯;第3类成分呈现起伏变化,为乙基邻苯二甲酸酯、乙基亚油酸酯和2-乙基己基草酸己酯。

2.6  黄精炮制前后二氯甲烷组分的抗氧化活性变化

参考文献方法[16],采用无水乙醇配制DPPH 0.1 mmol/L溶液,避光保存。取适量供试品溶液2 mL加入具塞试管中,加入DPPH溶液2 mL,摇匀,密闭放置30 min后,以80%乙醇溶液为空白,在517 nm处测定其吸光度(A2);取供试品溶液2 mL加入具塞试管中,加入80%乙醇溶液2 mL,摇匀,密闭放置30 min后,测定其吸光度(A0);取80%乙醇溶液2 mL加入具塞试管中,加入DPPH溶液2 mL,摇匀,密闭放置30 min后,测定其吸光度(A1);按照清除率=1(A2A0)/A1计算清除率,清除率越大,抗氧化能力越强。

相同生药质量浓度(40 mg/mL)的多花黄精及不同炮制时间的酒黄精DPPH自由基清除率结果(图3)显示,随着炮制时间的延长,二氯甲烷组分DPPH自由基清除率呈递增趋势,黄精清除率为33.31%,炮制至16 h达到最高为67.21%,随后炮制24 h32 h趋于稳定。

不同质量浓度的多花黄精及其16 h酒黄精的二氯甲烷组分DPPH自由基清除率结果(表5)显示,酒黄精二氯甲烷组分DPPH清除率随生药量的增加而增加;黄精DPPH半数抑制浓度(IC50)值为64.24 mg/mL,酒蒸16 h后的为23.41 mg/mLIC50值越低,抗氧化能力越强,可见酒黄精的抗氧化能力强于黄精。


相同生药质量浓度(40 mg/mL)的不同品种黄精炮制16 h后酒黄精,DPPH自由基清除率变化(表6)显示,经炮制后,滇黄精DPPH自由基清除率从18.89%增加至49.20%P0.05),黄精从36.89%增加至68.58%P0.05),多花黄精从33.21%增加至66.16%P0.05),3个品种黄精的二氯甲烷组分DPPH自由基清除率均明显增加。

3  讨论

3.1  Maillard反应物理化学特征分析

Maillard反应中间产物的紫外特征吸收波长是280 nm294 nm[8,17]。根据全波长扫描结果,选取最大吸收波长280 nm作为黄精及酒黄精的检测波长。黄精及酒黄精的二氯甲烷组分在280 nm波长下的紫外吸光结果显示,黄精经炮制后A280增加,且随炮制时间的延长,A280呈递增的趋势。表明黄精炮制过程中Maillard反应中间产物增加。滇黄精、黄精和多花黄精3个品种黄精炮制相同时间A280分别是生品的1.615.72.7倍,显示不同变化程度,可能与3个品种黄精的化学成分差异有关,因为MRPs与反应底物糖及氨基酸、反应条件等密切相关[18]

有研究以DPPH自由基清除率为指标,考察黄精中含量最高的氨基酸缬氨酸与葡萄糖/果糖发生Maillard反应时时间、温度、初始pH值和氨基与羰基物质的量比的影响,结果缬氨酸与2种单糖呈现了不同的最佳反应条件[19]。同时,黄精炮制后280 nm波长紫外A值的变化除了与MRPs有关,也可能与黄精中其他成分在炮制过程中的变化相关,还需要深入研究确定。

体系酸度降低是Maillard反应的特征[20]。黄精炮制过程中二氯甲烷组分的pH值测定结果显示,黄精炮制后pH值降低,且随着炮制时间的延长而呈递减趋势。Maillard反应过程中pH值降低,是由于氨基酸的碱性基团-氨基在加热过程中不断地与还原糖的羰基进行缩合,使得游离的氨基被封闭,致使体系的pH值不断下降[21]。当达到偏酸环境时,pH值下降速度减缓,因为中间阶段产生了缓冲液,包括有机酸、乙酰丙酸、丙酮酸等[22]。因此,推测黄精在炮制16 hMaillard反应速率降低。

3.2  炮制后MRPs分析

二氯甲烷是最常用的提取小分子MRPs的溶剂。Maillard反应很复杂,可产生不同种类的MRPs,起始阶段形成Amadori化合物[23],中间阶段产生呋喃类、吡喃类、糠醛类、吡咯类、吡啶类等化合物[24]终产物是蛋白黑素类[23]。分析显示,黄精炮制既有新的成分产生,也有之前存在成分的消失,同时,各成分比例也发生了变化。具有MRPs特征的成分有3-羟基二氢-2(3H)-呋喃酮、4-羟基二氢-2(3H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、3,5-二羟基-6-甲基-2,3-二氢- 4H-吡喃-4-酮。后2个成分是Maillard反应标志性成分[25],在何首乌炮制品制何首乌中也检测到这2个成分[26]5-羟甲基糠醛是162432 h酒黄精中占比最高的成分。反应产物在黄精及酒黄精质量评价的应用,还需深入研究。

3.3  炮制后抗氧化活性变化

研究表明大多数MRPs都具有抗氧化活性[27],而检测DPPH自由基的清除情况,可以评价样品的抗氧化活性,清除率越大,抗氧化活性越强。结果显示,随着炮制时间的延长,多花黄精二氯甲烷组分DPPH自由基清除率呈递增趋势,至16h达到最高然后趋于平稳。

多花黄精及其16 h酒黄精的二氯甲烷组分DPPHIC50比较显示,黄精炮制后IC50值降低,抗氧化活性增强;3个品种黄精经炮制后,其二氯甲烷组分的DPPH自由基清除率明显增强。Maillard反应中产生的一些小分子挥发性物质具有抗氧化活性,Eiserich[28]发现二氯甲烷提取的半胱氨酸与葡萄糖的MRPs中,有3种物质都拥有抗氧化活性,主要是噻唑类和呋喃酮类化合物。Maillard反应产生的一些挥发性产物,比如吡咯和吡嗪等都表现出了较好的抗氧化活性[29-30]

综上,研究结果提示黄精在炮制过程中发生了Maillard反应,使得酒黄精中含有特征性的MRPs 2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羟甲基糠醛等。随着炮制时间的延长,酒黄精抗氧化活性增强,至16 h达到最高随后趋于稳定。研究为黄精与酒黄精质量控制与炮制工艺规范化提供参考。

参考文献(略) 

来  源:王  淳,宋志前,宁张弛,梁东蕊,马新玲,万晓莹,刘振丽. 黄精炮制二氯甲烷组分Maillard反应产物及抗氧化活性研究 [J]. 中草药, 2019, 50(3):604-610.

来源:中药杂志社

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