分享一篇发表在JACS上的论文，题目为“Circular Engineered Sortase for Interrogating Histone H3 in Chromatin”，通讯作者有三位，分别是哈佛医学院的吴明轩教授，华盛顿大学的Benjamin A. Garcia教授，以及哈佛医学院的Philip A. Cole教授。吴明轩教授主要致力于化学生物学领域研究，包括蛋白的半合成，翻译后修饰，以及化学探针的开发等；Benjamin A. Garcia教授课题组主要是利用定量质谱蛋白质组学技术研究动态蛋白质修饰；Philip A. Cole教授的研究方向是利用化学生物学方法研究蛋白质翻译后修饰（PTMs），尤其是在信号传导、表观遗传学和癌症中的作用。
组蛋白尾部的翻译后修饰模式对于染色质的构象变化至关重要，其中组蛋白H3 N端修饰因其在基因调控中的重要性而备受关注。组蛋白H3 N端尾部的修饰包括Lys的乙酰化、甲基化和泛素化以及酰基化，上述修饰通常以不同的组合形式出现在组蛋白H3尾部。这些复杂的修饰模式影响染色质结构以及组蛋白修饰的写入、擦除和读取等相关功能。因此，解析H3尾部修饰是表观遗传学中的一个核心挑战。在这项工作中，作者报道了一种工程化的sortase转肽酶—cW11，它可以将带有修饰的H3尾部引入到核小体中，为解析H3尾部修饰的具体机制提供强大工具。作者以F40 sortase为基础，通过引入突变的方式以及骨架环化的方式形成酶cW11。sortase cW11表现出优异的活性，并具有序列选择性，从而用于切割组蛋白H3尾部，在此过程中会形成酶-硫酯中间体，该中间体会与Gly的N端进行连接。因此作者制备了GGGKX肽，其C端可以与TMT 6-plex NHS-酯试剂反应，于是就可以将H3尾部的修饰肽带上用于质谱定量的报告标签。基于该思路，首先作者提取细胞核后分离组蛋白，然后加入cW11以及GGGKX-TMT，经过三氯乙酸沉淀后，就能将H3尾部修饰肽与组蛋白分离，且可以直接用于质谱定量。作者通过SDS-PAGE验证了该方法的可行性后，评价了两种不同的去乙酰化抑制剂处理细胞后H3尾部PTM的模式变化。接下来，作者还使用cW11 sortase 构建H3尾部具有特定修饰模式的核小体。具体流程为：共表达无尾的H3和其他三种核心组蛋白，可以高效地生成H3无尾的组蛋白八聚体；然后在cW11 sortase驱动下，可以轻松地将单一和多重PTMs（如乙酰化、酰化和甲基化）引入核小体中，同时该方法还可以将两个H3尾部具有不同特定位点修饰模式的肽段引入到核小体中，构建不对称修饰的核小体。其具体实现方式就是首先获得单尾形式，然后单次色谱分离后进行第二步的衍生。接下来，作者基于这种方法继续探讨了不同酰基修饰对组蛋白H3尾部的去酰化酶（HDACs）活性的影响，结果表明不同的去酰化酶在去除各种酰基修饰时表现出不同的活性。总之，本文描述了一种工程化的sortase转肽酶——cW11，可用于无痕地将H3尾部修饰肽引入核小体。该方法显著加速了对称和不对称修饰核小体的生产，为解析组蛋白修饰的功能提供了强大工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c12585
文章引用：10.1021/jacs.4c12585
