分享一篇发表在Nat Chem Biol上的文章，文章题目为“Temporal photoproximity labeling of ligand-activated EGFR neighborhoods using MultiMap”，本文通讯作者为UCSF的James A. Wells，他们课题组主要的研究方向是细胞死亡和细胞炎症过程中的信号通路。

表皮生长因子受体（EGFR）是生长因子信号传导的经典范式，EGFR的活化与多个不同时间尺度的细胞信号传递步骤相关，EGFR也是癌症治疗的关键靶点。目前已经针对EGFR的细胞外结构域或者激酶结构域开发了多种抗体、小分子以针对癌症治疗，但是由于EGFR也存在正常细胞中，因此在正常组织中这些药物不可避免地出现剂量限制毒性。因此靶向EGFR相互作用物和其他癌症相关的伴侣蛋白开发药物可能解决此问题。

此前James A. Wells课题组在Science上发表了一篇工作（10.1126/science.adl5763），开发了MultiMap方法对EGFR的细胞膜外的相互作用蛋白进行了标记解析，该方法原理是将有机光催化剂Eosin Y与EGFR的抗体共价偶联，在蓝光照射下，该催化剂可以激活双吖丙啶、芳基叠氮和苯酚这三种光响应探针，这三种探针有不同的标记半径，因此可以在空间尺度上对EGFR的相互作用蛋白进行分析。在MultiMap中，作者是把Eosin Y与西妥昔单抗偶联，从而实现对EGFR的靶向，但是西妥昔单抗与EGFR结合之后，会阻断EGFR的信号传导，无法检测EGFR在不同信号传导过程中，邻近蛋白质组的变化，因此本文作者便是在MultiMap基础上，对方法进行了改进，可以对配体激活的EGFR邻近蛋白质组进行标记。

为了实现上述目的，作者选择对EGFR进行改造，作者构建了两种EGFR，一种是在细胞外结构域（ECD）的N端偶联FlagTag，另一种是在细胞内结构域（ICD）的C端偶联HaloTag，然后将Eosin Y与FlagTag的抗体或者HaloTag的小分子配体偶联，实现催化剂的锚定。加入EGF孵育，使EGFR处于激活状态，之后再进行蓝光照射，激活三种标记半径不同的光响应探针，实现对激活的EGFR细胞内外相互作用蛋白质组的标记。

作者首先构建了带有不同标签EGFR的细胞，并检测了标签的添加对EGFR的功能没有影响。之后作者研究了EGF激活5 min后，EGFR的邻近蛋白质组变化，通过ECD标记策略，作者鉴定到了许多显著富集的蛋白，其中包含一些已知的与EGFR直接相互作用或者功能上与之相关联的蛋白，例如Rab11a、EPS15等。为了证明该方法可以以时间分辨率标记EGFR邻近蛋白质组，作者又用ECD标记策略，分析了EGF刺激60 min后，EGFR邻近蛋白质组的变化。比如Rab11a是在5 min节点时，富集程度最高的蛋白，但是60 min刺激后，其含量显著下降，这表明Rab11a与EGFR迅速结合后解离，EPS15与Rab11a表现类似。

之后，作者利用ICD策略，分析了EGFR受刺激之后，细胞内邻近蛋白质组的变化，质谱分析结果表明ICD策略可以富集到许多已知的EGFR邻近蛋白，比如SHP2、PDLIM5、PDLIM7等，且ICD策略和ECD策略富集到的蛋白重合度较低，说明两种策略可以互补，共同绘制EGFR经EGF刺激后，邻近蛋白质组的变化。最后作者用对发现的一些邻近蛋白进行了验证。

综上所述，作者在此前开发的MUltiMap技术基础上，对EGFR进行改造，可以实现时间分辨率地分析激活后EGFR邻近蛋白质组的变化。

本文作者：LZ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/acschembio.5c00751

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-02076-y