早在1959年《药物化学杂志》创刊伊始，便有了乙炔（乙炔基）在药物化学中应用的记载。此后，乙炔基在药物的发现和开发中得到了广泛的应用。在药物活性中发挥多种作用，其中包括效力增强（通过与受体结合口袋的互补配合)、反应弹头（不可逆地抑制目标蛋白） 、非极性线性刚性间隔（使药效团附属物以有利的几何形状进行组装）、众多官能团的生物等排体(即氰、氯、碘、酰胺、乙烯、羰基、乙基、苯基和环丙基)以及药物代谢动力学(DMPK)的调节。此外，化学生物学探针中经常引入端炔基团，作为识别分子靶点以及评估目标靶点参与情况的可点击手柄。然而，对非目标分子CYP450/GSH等的共价抑制也使得乙炔基团也具有一定的毒副作用。发展至今，乙炔基团的已知特性如下图所示：
图1 乙炔基团的特性
乙炔，由埃德蒙·戴维于1836年发现，是一种无色无味的气体。它由一个碳碳三键组成，其中具有一个σ键和两个π键。乙炔的三键较短(1.21A)，但稳定性强于碳碳双键(1.34A)或单键(1.53A)。例如，乙炔的π键断裂需要318kJ/mol，而乙烯π键断裂则只需要268kJ/mol。由于其S轨道的增加，乙炔C-H键(1.06A)比相应乙烯(1.08A)或乙烷(1.09A)的C-H键短。当它与烷基基团相连时，乙炔基团是通过超共轭(π键与相邻的C-H键重叠)来实现稳定的。因此，内炔比端炔更稳定。由于乙炔是一个弱吸电子基团，它可以作为质子的供体。因此与相应的烯烃(pKa~44)或烷烃(pKa~50)相比，端炔是更强的Bronsted酸(pKa~25)。乙炔基的H-C-C键角是线性的（夹角呈180度)，因此它可以作为一个刚性的间隔，使得取代基处于乙炔基的同一平面上。乙炔基团π键体系提供的供体-受体相互作用与在苯环中观察到的类似，因此，它也可以作为苯基的电子等排体。
虽然乙炔是一种碳氢化合物，但它被认为是一个官能团，因为它的C-H键可以在碱性条件下去质子化，产生共轭碱。同样地，它可以在亲电π键上进行亲核加成。因此，乙炔基团在许多基团的合成中占有重要地位，包括烷烃、烯烃、醛、卤化物、杂环和闭合环分解等反应。铜催化的叠氮和炔基的[3+2]环加成(CuAAC)反应，可迅速生成1,4-二取代的1,2,3-三唑，是一种典型的“点击化学反应”，该反应在医药化学中被广泛应用于先导物有效优化。
基于乙炔基的电子排布特点，乙炔基团被看做是一种非典型的生物等排体。在生物体内可进行等效替换的官能团有氯、氰、碘、乙烯、乙基、羰基、羧胺、苯和环丙基等基团。在乙炔、乙烯和苯基中存在相似的π键体系和供-受体相互作用，使它们成为彼此的生物电子等排体。它的π电子云与芳香环的非常类似，其极化的-CH键有弱的氢键供体作用，并可以被碘原子取代。此外，氯、溴和碘取代的苯的分子静电势与苯乙炔的分子静电势相似，乙炔基和苯之间的键长与碘原子与苯的键长相当，而且乙炔的弱氢键能力与卤素键的强度相当，通过Sonogashira偶联反应，芳香环上碘原子可轻易被乙炔基等电置换。由此可见乙炔为卤素的生物电子等排体。氰基和乙炔基团在结构上有相似之处，均存在sp杂化中心，空间上呈现短的极化的线性三键。进一步研究表明，乙炔中的sp杂化末端碳的电负性为3.29，而氰基中的sp杂化氮的电负性为5.07，表明两者都是吸电子基团，并且氰基比乙炔的吸电子能力更强。因此，乙炔和氰基可互为生物等排体。此外，乙炔基团还可以功能性的模拟酰胺、羰基、乙基和环丙基等基团，这可以通过本文提供的例子得到验证。
以Mtb（结核分枝杆菌）中PknA/PknB双抑制剂1和2为例，具体阐述乙炔基作为生物等排体在药物化学中的应用。结核分枝杆菌的蛋白激酶A(PknA)和蛋白激酶B(PknB)由于其在细菌细胞生长中的重要作用，药物研发时以该两种激酶为靶点，以获得有效的抑制剂，从而降低结核分枝杆菌耐药性。如图2所示，研究表明，化合物1对两种激酶具有微摩尔级别的抑制作用。但对哺乳动物细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK2的选择性较差。1与PknA和PknB结合的X射线晶体结构显示，甘氨酸残基翻转形成的口袋(Gly100 in PknA and Gly97 in PknB)导致化合物1对哺乳动物细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK2的选择性较差，而对Mtb激酶的选择性较好。化合物2中是用5-乙炔基取代化合物1中的5-氯基时，不仅保持了化合物2对Mtb激酶的效力以及抗菌活性，还提高了对CDK2激酶的选择性。由化合物1与2的抑菌效力可见，炔基与卤素氯互为生物等排体。
图2 化合物1、2的结构及其在体内的相关性质
Dragovich和他的同事报告了人类鼻病毒3C蛋白酶2-吡啶酮类抑制剂的药代动力学优化过程。如图3所示，化合物3中存在的3，4-二氟苄基部分被一个炔丙基所取代以获得化合物4，虽然效力有所下降。但化合物4的极性、水溶性、代谢稳定性增加，血浆半衰期延长，药代动力学性质显著改善。
图3 人鼻病毒3C蛋白酶抑制剂3（图左）和4（图右）的结构及其体外效力和DMPK数据
开发具有明确靶向性的抑制剂一直是药物学家限制脱靶效应的首要任务。为了实现这一目标，可在分子内插入乙炔基团以提高分子靶向性。DPP-4抑制剂即二肽基肽酶 Ⅳ抑制剂，是治疗2型糖尿病的新靶点, 能够迅速灭活肠促胰岛素胰高血糖素样肽-1( GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)等多种激素。提高内源性GLP-1和GIP的活性,促进胰岛B细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛 A 细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不会诱发低血糖和增加体重。在二肽基肽酶 Ⅳ抑制剂（DPP-4）抑制剂中插入乙炔基团增强其靶向性成为DPP-4特异性抑制剂，对与其密切相关的DPP-8和DPP9亚型则不具备抑制性。如图4所示，在化合物5的2-氰基吡咯烷部分的C5位置安装了一个乙炔基团，得到化合物6，与5相比，6对DPP-4选择性与DPP-8和DPP-9相比有相当大的提高。在吡咯环上保留氰基和乙炔取代基的基础上，用C4-甲基哌啶取代了环己基羟基连接剂，并用异烟酸替换氰吡啶环获得化合物7（ABT-279）。 进一步提高了对DPP-4的抑制效力和选择性，对特异性治疗2型糖尿病药物的研发提供新途径。
图4 DPP-4抑制剂5-7的结构和体外效力
炔基由于其狭小的棒状结构而被广泛用作化合物内部的结构基序，以穿过靶蛋白内的空间限制通道。作为富电子基团，可增强与活性位点芳香残基的π-π相互作用。它还是一种对空间要求较低的高效连接剂，可创造出与目标大分子上两个相邻结合位点特异性结合的对称二聚体化合物。此外，它还可作为连接基团限制化合物的空间构象以及提高目标选择性。以Bcr-Abl激酶抑制剂的发现 揭示了乙炔在化合物结构中发挥的作用。
BCR-Abl激酶在慢性粒细胞白血病(CML)中起着关键作用，因此，它是肿瘤学的重要靶点。如图5所示，化合物8（伊马替尼）在CML患者中的临床耐药性与BCR-Abl激酶中保守残基Thr315Ile的突变有关。Ile315的侧链变异膨胀后，与药物伊马替尼结合时产生空间碰撞，导致结合亲和力丧失，从而产生耐药性。在伊马替尼结构中的腺嘌呤结合部分和变构口袋结合部分之间用乙炔做连接基产生的化合物9（帕纳替尼），有效的避免了与BCR-Abl激酶中Ile315庞大的侧链发生空间冲突。但帕纳替尼也具有血块和血管狭窄等副作用。为此，药物学家使用一个新的腺嘌呤结合部分和变构口袋结合部分通过炔基连接产生了化合物10。化合物10对野生型以及Thr315Ile突变型BCR-Abl激酶均具有良好的抑制性。
图5 8-10的结构及相应Bcr-Abl激酶抑制活性
针对特定目标蛋白的高选择性共价抑制剂在临床上的应用越来越广泛，然而，抑制剂中使用高活性的亲电弹头有可能导致对非目标蛋白不加区分的共价修饰并产生毒性。因此，使用反应活性较低的亲电弹头基团，如炔基，则成为不可逆亲电抑制剂研发的重点方向。以将组织蛋白酶K(CatK)的可逆抑制剂11（Odanacatib）转化为不可逆的潜在亲电抑制剂12为例，阐述乙炔在不可逆抑制剂中作为潜在亲电基的应用。
在破骨细胞Cat K中过表达的半胱氨酰蛋白酶参与了骨降解过程。因此，CatK的小分子抑制剂对于治疗骨质疏松症是有用的。化合物11(odanacatib)由于存在与半胱氨酸具有反应性的腈基，是一种高选择性的Cat K可逆共价抑制剂。由于不可逆抑制剂中的高活性亲电基团伴有的特定毒性，Mons和同事开发了含有低活性弹头的CatK不可逆抑制剂，如N-proparylamide。研究人员用炔基取代了11中的腈基，却发现化合物水溶性降低，这一问题通过去除疏水螺环丙基部分解决，产生化合物12。与已知的丙炔酰胺弹头相比，12中N-丙炔酰胺弹头表现出较低的亲电性。化合物12中丙炔酰胺键通过与CatK中半胱氨酸的硫原子形成不可逆硫醚键从而发挥抗骨质疏松的作用。12对CatK的不可逆抑制作用机制如下图所示：
图6 蛋白酶K(CatK)可逆共价抑制剂11和不可逆共价抑制剂12的结构及其作用机制
配体分子大分子水平机理的确定，包括目标受体和非目标受体的识别，已成为化学生物学中研究的关键领域。插入分子手柄，如炔基或叠氮，通过荧光读出或亲和纯化后进行质谱分析，可以检测细胞蛋白质组中的目标结合蛋白。因此，铜-(I)催化叠氮-炔[3+2]环加成反应(CuAAC)在许多化学生物学研究中起着关键作用，使环肽的产生和抗体治疗学的发展成为可能。含炔探针在生物化学领域的应用十分广泛：用于标记埃博拉病毒感染的目标蛋白、青蒿素检测、CYP450共价标记、活性蛋白分析(ABPP)、跟踪万古霉素诱导的细胞壁变化等。
抗万古霉素肠球菌(VRE)是公共卫生的难题。万古霉素的抗菌作用机制为抑制存在于真细菌中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖（PG）生物合成。PG顶端为五肽链组成的双糖，该五肽具有末端D-Ala-D-Ala肽序列。VRE细菌细胞通过合成顶端为D-Ala-D-乳酸的PG前体，进一步合成PG，因此，VRE细菌细胞可以在万古霉素的压力下生长和增殖。为了解PG可塑性结构与VRE细胞的关系，皮吉恩和他的同事设计并研究了化学探针17（如图7），一种含有端炔基的抗万古霉素肠球菌底物D-乳酸的类似物。该探针的特点是含有一个适合CuAAC点击化学的炔基“化学手柄”，VanB连接酶将利用这种改性底物产生D-Ala-D-laclick PG-锚，随后，用叠氮荧光团如6-羧基荧光素叠氮化物(6-FAM-azide)与炔基手柄进行CuAAC点击化学反应。通过观察荧光水平的增加，表明万古霉素肠球菌耐药的过程（如图7）。皮吉恩和他的同事假设，模拟D-Ala-D-Ala二肽，合成D，D-二肽酶(VanX)底物类似物如18，将允许在体内询问VRE细菌细胞中的Van X活性。二肽18具有与6-FAM-zaide进行点击化学反应的炔基探针。这种化学探针荧光的减少，表明万古霉素肠球菌的耐药性降低。
图7 含炔探针17(D-乳酸)和18（二肽）结构及相应作用机制
乙炔基作为动力学靶向合成(KTGS)的点击反应“手柄”
KTGS是利用原位点击反应可生成的分子来抑制靶点 大分子(蛋白和DNA)作用，为先导物质的鉴定和优化提供了一种很有前途的策略。在KTGS中，一对具有互补反应性的高度亲和力的片段与目标受体结合，受体加速高亲和力片段间共价键形成，通过稳定互补片段与受体形成的三元配合物产物构象，使互补反应性的片段之间的反应不可逆，从而对目标受体自身产生抑制作用。（如图8A所示）Antti和同事用碳酸酐酶II抑制剂进行了以细胞为基础的KTGS研究。例如，将具有丰富的碳酸酐酶II的牛血红细胞在叠氮化物19和含炔化合物20中培养，以实现化合物21的靶向合成（如图8B所示）。叠氮化物19与含炔化合物20是具有高度亲和力的互补片段，分别与RBCs/bCAII相应位点结合后，在RBCs/bCAII中发生点击化学反应下形成共价键，生成化合物21。21与RBCs/bCAII的稳定结合使RBCs/bCAII的功能得到抑制。
图8 A靶向合成先导化合物示意图 B以细胞为基础的KTGS
乙炔基作为抗体-药物偶联物(ADC)开发的点击反应“手柄”
抗体-药物偶联物(ADC)是一种通过化学连接物将高细胞毒性小分子(有效载荷)与人源化或人源性单克隆抗体连接产生的结合物，是一种新型的治疗药物，在癌症化疗中具有巨大的潜力。如图9，格雷格森和他的同事报告了吡咯苯并二氮卓类药物连接剂的设计，发展了使用关键中间体22的ADC。关键中间体22通过 Sonogashira反应以乙炔基取代碘原子生成化合物23，或通过对22进行乙炔基取代，随后与适当功能化叠氮基发生点击化学反应生成化合物24。23或24的马来酰亚胺部分与抗HER2/抗CD22抗体的半胱氨酸结合形成ADC。这些ADC是由马来酰亚胺基与HER2/ CD22抗体的半胱氨酸结合形成偶联物、一个亲水间隔、一个炔（23）或者一个1，4取代的1,2，3-三唑（24）与吡咯基苯二氮杂卓相连构成。
图9 吡咯-苯二氮卓二聚体22的结构及相应含炔/三唑基的抗半胱氨酸HER2或抗CD22抗体23、24结构
由于乙炔在共价抑制剂设计和化学生物学研究中的应用，临床上有用的含炔分子数量正在上升。尽管偶有位于分子内部和末端的乙炔对CYP酶有抑制的倾向，但它们已经在药物化学中产生了许多有意义的贡献。且合成乙炔的原料便宜易得，路线简易，考虑到它们在化学生物学上的用途，预计乙炔在药物化学中的应用会越发广泛。
参考文献：
[1] Acetylene Group, Friend or Foe in Medicinal Chemistry，Tanaji T. Talel，Journalof Medicinal Chemistry ArticleASAP，DOI:10.1021/acs.jmedchem.9b01617
注：本文图片来源于参考文献
