有机磷农药(organophosphorus pesticides, OPs)由于具有成本低，合成简便，对害虫防治活性高等优势，已经成为现代农业中使用最广泛的杀虫剂。因此，它的检测是一个日益严重的公共卫生问题。作为乙酰胆碱酯酶(AChE，一种关键的神经系统酶)的底物类似物，OPs通过抑制AChE催化乙酰胆碱(ACh)水解发挥其毒性作用，导致ACh的过度积累从而引起胆碱毒性。 在过去的几十年中，已经建立了如液相色谱(LC)、气相色谱(GC)和质谱(MS)等方法检测低浓度的OPs，但是这些方法的仪器昂贵，处理步骤繁琐，分析速度慢，在现场检测中受到限制。目前，一种简单有效的检测OPs的策略是使用基于酶的方法，该方法响应速度快，但由于酶易受环境影响，稳定较差。随着纳米技术的进步，研究者尝试将AChE固定在纳米材料上以开发具有低检测限，快速响应和稳定性好的检测OPs的生物传感器。 石墨烯作为一种二维(2D)材料，具有较高的表面积、电子迁移率、导热性和机械强度，最近报道的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)还具有类过氧化物酶的活性，使其成为生物分析中天然酶的有效替代品。然而，很少有报道使用GO的内在类过氧化物酶活性来灵敏地检测OPs。 近日，吉林大学罗全教授与刘俊秋教授共同在《Nanoscale》发表了题为“Graphene oxide-based colorimetric detection of organophosphorus pesticides via a multi-enzyme cascade reaction”的研究论文。在该研究中，作者将合成的尺寸可调的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)作为辣根过氧化物酶(HRP)模拟物，用于通过级联反应比色检测纳摩尔浓度的有机磷农药(OPs)。这种基于GO比色法检测OPs的方法具有高灵敏度和稳定性，在公共卫生应用领域具有巨大潜力。 示意图为通过多酶级联反应对OPs进行比色分析的原理图。其中BA表示甜菜碱醛；oxTMB表示氧化的TMB。作者首先使用改进的Hummers方法制备尺寸可调的GO。该多酶级联方法需要三种酶：AChE、胆碱氧化酶(choline oxidase，CHO)和GO依次起作用，其中AChE/CHO可以催化ACh和胆碱形成H2O2，从而激活GO将3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色产物。OPs对AChE的抑制作用导致H2O2产量急剧下降，导致视觉上颜色强度的变化，从而可以识别出各种低含量的OPs(例如乐果，甲基对氧磷和毒死蜱)。 图一为通过改进的Hummers方法合成的GO-1和GO-2片层的AFM(a和b)和TEM(c和d)图像。 AFM图像表明，GO-1的平均直径只有几微米，厚度为1.4-2.1 nm (图1a)，比单层石墨烯(0.7-1 nm)厚约2-3倍。相比之下，剥落的GO-2薄片比GO-1小得多。图1b显示的是高度为0.8-1.7 nm的纳米片的形成，对应于1-2层的石墨烯结构。TEM图像进一步表明，GO-1具有5-10 μm的细皱纹结构，而GO-2具有更不规则的形状，尺寸分布为100-200 nm(图1c-d)。这些结果与AFM数据一致，表明GO片层的尺寸可以通过合成条件轻松控制，利于后续基于酶方法的检测。 图二为GO-1(a和c)和GO-2(b和d)的全扫描X射线光电子能谱(XPS)和高分辨率C 1s能谱。由于先前有关碳纳米材料催化机理的报道表明，GO的HRP活性高度依赖于其功能性氧基团(-C=O和O=C-O-基团)。因此，作者首先通过XPS分析来测量两个GO片层的化学状态。如图2a和2b所示，在XPS光谱中观察到了285和533 eV处的两个强烈峰，这表明GO-1和GO-2具有相同的C和O主元素。XPS C 1s光谱可以进一步分解为三个不同的峰，其结合能分别为284.6 eV，286.6 eV和288.6 eV，分别对应于C=C/C-C，C-O和C=O键的峰。 图三 (a)在不存在或存在GO纳米片的情况下，TMB/H2O2反应溶液在652 nm处的时间依赖性吸收曲线；(b) GO-2在0至18 μg mL-1的浓度范围内具有剂量依赖活性；(c)和(d)分别为用于GO催化的最佳pH和温度探索。由于GO具有类过氧化物酶活性，作者首先使用TMB-H2O2系统，通过652 nm处TMB的吸光度变化来评估GO-1和GO-2的活性。图3a显示了在含0.4 mM TMB和50 mM H2O2的pH 4.0 HAc-NaAc缓冲液中，有或没有GO时溶液随时间的吸光度变化。结果表明，单独的H2O2几乎不能氧化TMB引起显著的颜色变化，而加入GO纳米片后，该反应显著加速，且相较于单独的GO-1，GO-2具有更高的HRP活性。图3b的结果表明，GO-2的反应速率随其浓度的增加而增加，活性显示出剂量依赖性。此外，作者还研究了pH，温度和H2O2浓度对GO相对活性的影响。在pH 4.0时，GO拥有最大的相对活性(图3c)，最佳温度为35°C (图3d)。 图四 (a) GO-2/AChE/CHO介导的将TMB氧化为蓝色oxTMB的反应；(b)用于基于GO比色分析AChE的剂量依赖性曲线；(c-e)为OP检测的剂量反应曲线和半对数图(插图)，其中，图c-e分别对应于检测乐果、甲基对氧磷和毒死蜱。图4a结果表示，在没有OPs的情况下，GO-2/AChE/CHO/TMB系统显示深蓝色，而在其余两种系统中均未观察到明显的颜色变化，表明AChE/CHO催化反应释放H2O2导致GO-2催化TMB氧化。图4b结果表示，反应溶液的颜色强度与AChE的浓度有关，表明该实验可通过抑制AChE活性，基于比色法检测残留的OPs。对乐果、甲基对氧磷和毒死蜱的检测限分别为2、1和2 ppb (ng mL-1)。 作者开发了一种基于GO的比色法用于OPs的灵敏检测。结果表明，该方法检测乐果、甲基对氧磷和毒死蜱的相应LOD低于2 ppb，均低于中国国家食品安全标准采用的最大残留限量。此外，该检测可以在40分钟内完成，对浓度在1–200 ng mL-1范围内的OP具有线性响应(R2值超过0.99)，显示了其对农药残留进行定量分析的巨大潜力。 罗全教授，2009年毕业于吉林大学理化所，获理学博士学位。同年，加入超分子结构与材料国家重点实验室任讲师，2012年晋升为副教授，2018年晋升为教授。2015-2016年在美国明尼苏达大学化学系做访问研究。主要研究兴趣包括计算生物与分子模拟，仿生催化与组装，生物超分子功能材料等，相关成果在Chem. Rev.，Angew. Chem. Int. Ed.，ACS Catal.，ACS Appl. Mat. Inter.等国际SCI刊物上发表论文30余篇，累计他引674次。近年来，主持国家自然科学面上基金2项，青年基金1项，以及3项省科技厅重点研发项目/面上基金/青年基金，并获吉林大学优青培育计划和优秀青年教师培养计划等项目支持。 研究兴趣： 1.计算生物与分子模拟 2.仿生催化与组装 3.生物超分子功能材料 刘俊秋教授，1987年毕业于吉林大学化学系，1999年在吉林大学化学系高分子专业分别获理学硕士和博士学位。2002-2003年获洪堡基金资助在德国从事博士后研究。2004年获吉林省“首批拔尖创新人才”称号，同年入选教育部“新世纪优秀人才培养计划”。2005入选吉林省创新人才工程。2010年获得吉林省有突出贡献的中青年专业技术人才称号。2011年被评选为吉林省高级专家。主持或参加了多项国家863、973、自然基金重点研究项目等。近年来在Chem. Review, Chem. Soc. Review，Acc. Chem. Res.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed等杂志已发表SCI研究论文150余篇，获得吉林省科技进步一等奖1项(排名第一)。 研究兴趣： 1.仿硒酶工程研究 2.超分子仿酶研究 3.蛋白质组装与功能化 原文链接：https://doi.org/10.1039/C9NR10862A DOI: 10.1039/c9nr10862a 编辑：周一党 审核：CK 推送：小䜣
