利用群集式生物正交反应在活细胞表面原位合成树枝状高分子

给大家分享一篇近期发表在JACS上的文章，题为Bioorthogonal Swarming: In Situ Generation of Dendrimers。文章的通讯作者是来自爱丁堡大学的Mark Bradley教授及Annamaria Lilienkampf教授。

由于树枝状分子一般具有明确的结构、高密度的官能团以及多种内部结合位点，常应用于递送蛋白质与小分子药物、细胞成像等多种生物医学研究中。在活细胞表面合成线性高分子已经取得进展，但尚未报道过树枝状高分子在活细胞表面的原位合成。本文中作者通过一系列连续的“群集式”生物正交反应制备树枝状分子，并与靶向细胞受体的赫赛汀抗体偶联，从而将树枝状分子引入到细胞表面，整体设计如图1所示。

图1. “群集式”生物正交反应的概念

为完成顺序进行的生物正交反应，作者首先设计合成了三种具有双正交反应活性位点、且多分支的结构单元，1，2，3，具体结构如图2所示（其中同一颜色标注的为一个正交反应对）。结构单元1作为树枝状分子的起始，右端的活化酯用于与伯胺反应，例如与赫赛汀抗体中的氨基反应进行偶联。左端（绿色）分支的三个醛均可与结构单元2中的羟胺（绿色）进行偶联，这是第一个生物正交反应对。而结构单元2的两端分别为单个羟胺及三个降冰片烯（红色），由此，发生偶联后三个醛就被放大为九个降冰片烯。类似的，结构单元3的两端分别为单个四嗪（红色）与两个醛，四嗪与降冰片烯可以发生逆电子需求D-A反应，这是第二个生物正交反应对。最终，8为荧光素酰肼，通过酰肼与醛的反应对树枝状分子进行荧光素的标记。理论上，通过结构单元1，2，3顺序反应获得的第三代树枝状分子共具有十八个醛基。

图2. 用于制备树枝状分子及进行荧光标记的结构单元

接下来，作者首先通过HPLC及核磁氢谱确认了各步生物正交反应能够快速并以高收率和高产物纯度进行。随后，如图3所示，作者以Cy5作为模型与结构单元1偶联，并顺序加入其它的结构单元制备完整的树枝状分子，评估荧光信号的放大。紫外-可见光谱的结果表明，最终形成的树枝状分子上荧光素数目为17.7，这表明树枝状分子的成功形成并且可以实现信号放大。

图3. 以Cy5分子为模型制备树枝状分子

进一步地，作者将这一体系成功应用于赫赛汀抗体。其中，抗体与结构单元1偶联（结构如图4所示，Her-1），每一步骤的产物分离都经过SDS-PAGE的表征。

最终，作者在SK-BR-3细胞（过表达赫赛汀抗体靶向的Her2受体）上原位制备树枝状分子。细胞首先与Her-1孵育，随后顺序加入结构单元2，3，8，最终得到带有荧光标记的Her4，如图4所示。通过共聚焦显微镜与流式细胞术进行分析，并与直接用荧光素标记的赫赛汀抗体FAM-Her的荧光强度进行比较。由图4C可见，相比于FAM-Her，具有Her4的细胞表面荧光强度增加4.6倍。这表明制备的树枝状高分子在活细胞表面放大荧光信号的作用。