今天跟大家分享一篇近期发表在Cell上的文章，题目是LanCLs add glutathione to dehydroaminoacids generated at phosphorylated sites in the proteome。本文的通讯作者是伊利诺伊州学院的Wilfred A. van der Donk教授，其主要研究方向为发现和设计新的抗生素和天然产物，并将合成有机和蛋白质化学相结合，以解决化学和生物学之间的问题。
在细菌中由脱水酶（Nis C）介导的前体肽中的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基转化为脱氢氨基酸(Dha/Dhb)，并由Nis C中LanC型结构域介导，将Cys巯基分子加成到Dha/Dhb残基上，避免过多的Dha/Dhb对细菌造成不可逆的核酸损伤。而在真核细胞中，磷酸化的Ser/Thr也会转为Dha/Dhb。但由于Dha/Dhb是反应性亲电残基且不能被重新磷酸化，而Dha/Dhb过多会产生蛋白质交联，从而造成蛋白质损伤。在哺乳动物各种组织中普遍表达LanCL蛋白，具有与细菌的Nis C相似的结构。该蛋白能够与GSH结合，于是作者研究了LanCL蛋白是否与Nis C具有类似的功能。
作者首先比较了细菌Nis C与哺乳动物LanCL蛋白的结构，发现两者结构相似类，均由双层螺旋构成且有与金属离子结合的位点。将LanCL蛋白结构放大，可以观察到结合的残基与连接GSH部分。重要的是，LanCL2中与金属离子的结合残基这些残基在细菌LanC蛋白或LanM蛋白的LanC结构域中并不保守，而在真核LanCL中高度保守，这表明与细菌LanC/LanM相比，真核LanC具有一种共同的、独特的和未被发现的功能。作者接下来使用C- His标签的哺乳动物中的LanCL蛋白进行pull down实验，并发现LanCLs能够与其他哺乳细胞激酶相互作用，表明LanCL蛋白对激酶具有广泛的结合亲和力。
细菌LANC结构催化Cys与Dha/Dhb的分子内加成。通过扩展逻辑，研究了LanCLs蛋白是否能够催化分子间GSH加成到含Dha或Dhb的肽序列上。LanCL蛋白可能催化脱氢氨基酸的迈克尔型加成的可能性以前已经被预先假设过，但没有经过实验验证。因此使用裂解酶SpvC和OspF裂解酶以制备与ERK和Akt的含有Dhb的多肽，并使用MALDI-TOF MS检测去磷酸化过程。之后利用制备好含有Dhb的多肽模型与不同的LanCL蛋白进行孵育，mut代表突变，在突变体LanCl1/2中，序列和结构上与NISC活性关键的氨基酸相对应的残基发生了突变，作者通过MALDI-TOF MS研究了LanCLs和含Dha/Dhb的多肽模型的反应物，并成功观察到其GSH加合物，说明LanCLs可以催化分子间GSH加合到与相对应的含Dha/Dhb的肽序列上。
图1
接下来作者以哺乳动物中的激酶MEK1作为研究对象进行下一步实验，由于MEK1包含几个存在的天然Cys残基，并且在初步实验中，移除这些天然Cys造成了功能改变和表达问题；因此，这些观察结果阻止了直接应用依赖于完全移除天然Cys残基的先前方法。因此，我们考虑了一种更具挑战性的方法，即在存在其他非靶标天然Cys残基的情况下，将目标半胱氨酸残基区域选择性地化学转化为Dha。于是用试剂DBHDA为主体，进行合成新的小分子，以进行下一步实验。目的为将游离Cys残基化学转化为Dha。第一步不可逆烷基化反应是速率选择性决定的，因此也是区域选择性决定的（图2）。
图2
接下来作者设计了MEK1的三个突变变体，用于用这种区域选择性消除化学方法进行测试：MEK1-C218、MEK1-C222和MEK1-C218C222。将这三种突变体与合成的DBHDS小分子结合使用，允许选择性地访问到不同的MEK1激酶，合成含Dha的MEK1。但是发现DBHDA小分子会与其他位点结合形成小分子，于是采用了磷酸化方法磷酸方法，可以看到在磷酸化结合小分子DBHDA的情况下，仅在相对应的位置生成Dha。
接下来作者研究了LanCL蛋白和含脱氢氨基酸的MEK1之间的相互作用，Pull-down实验表明LanCl2与含脱氢氨基酸的MEK1有直接的物理相互作用。接下来研究了C-谷胱甘肽基化活性。用WT LanCl1/2和GSH处理含Dha的MEK1，并使用MS监测反应，观察到有GSH加合物，而与没有LanCL无GSH加合物的产生。在GSH含量增加的情况下，使用完整蛋白MS进行动力学分析，并绘制GSH结合物的初始形成速率与底物浓度的关系图。结果表明，LaCl1和LanCl2催化含脱氢氨基酸的MEK1的C-谷胱甘肽基化反应，其中LanCl1的催化活性高于LanCl2。证明了LanCLs将GSH加成到Dha/Dhb上为酶促反应。
为了进一步研究底物范围，接着研究了多种肽与LanCL2的反应性。可以看出GSH与WT LanCL2蛋白结合，但不与突变体LanCL2结合。同时选择的多肽含有不同数目的Dhb，但形成的GSH加合物与其含有的Dhb的数目并不相同，推断这是由于LanCL蛋白具有选择底物特异性及立体选择性，即醚键可能通过空间位阻阻止LanCl2将谷胱甘肽加到环内的脱氢氨基酸残基上。由于GSTA4催化Michael加成类型的加成反应，用含有Dhb的ERK与LanCl2平行测试了它的活性，并用MALDI-TOF MS对反应混合物进行了监测。LanCl2-ERK处理观察到GSH加成物的生成，而GSTA4-ERK没有观察到GSH加成物的生成。图3证明LanCLs具有立体选择性且能够将GSH加成到相应的Dha/Dhb上。
图3
最后将MEK1-Dha与WT或去除LanCL1-3 TKO小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞裂解物孵育， Western blotting检测到LanCL1和LanCL2在WT MEF细胞中表达，而在TKO MEF细胞中未见表达。其他蛋白不会向Dha中添加GSH。WT小鼠与TKO小鼠进行对比，敲除LanCL基因的TKO小鼠在6个月后显示出更高的死亡率（图4）。
图4
综上，LanCL蛋白是可作用于含Dha/Dhb的蛋白质，并且在分子间方式催化偶联物的添加，在激活环中催化含Dha/Dhb的肽和激酶，从而驱动不可逆的C-谷胱甘肽化。
