硫醇-二硫化物交换作为聚合物纳米颗粒内体逃逸的途径

分享一篇发表在Angew. Chemie上的文章，题为：Thiol-Disulfide Exchange as a Route for Endosomal Escape of Polymeric Nanoparticles。本文的通讯作者是来自University of Massachusetts Amherst的S Thayumanavan。

基于聚合物的纳米粒子已被广泛应用于药物递送。纳米粒子进入细胞最主要的途径是内吞，内吞后这些药物载体最初被困在囊泡结构的内体中，而药物分子通常需要在溶酶体外的细胞质或其他亚细胞区室中才能发挥治疗作用，因此，纳米载体的内体逃逸对于药物递送过程来说是至关重要的。内体逃逸可以利用内在刺激，来诱导内体膜破裂。例如结合一些可以增强内体中pH 缓冲功能的部分、与内体膜融合、在载体中加入内体溶解剂，以及使用细胞穿透肽。然而，更加稳健、可靠的内体逃逸策略仍有待开发。

研究显示，含二硫键的分子和聚合物表现出更强的细胞摄取和胞质定位。例如，聚(二硫化物)已被开发用于非内吞的细胞内化。然而，对于体积较大的载药纳米颗粒来说，二硫键对其细胞摄取的影响尚未可知。因此，本文作者研究了二硫键对纳米颗粒在细胞摄取和内体逃逸两个过程中的影响，并发现二硫键能够赋予纳米颗粒内体逃逸的能力。

作者假设带有二硫键的纳米颗粒和外表面硫醇之间潜在的共价接触，不仅会促进细胞摄取，还会增强这些纳米颗粒的内体逃逸。这个想法的前提，是这种共价接触会导致内体膜变形，所产生的应变将促进内体逃逸(图1)。

图1. 假设二硫键赋予聚合物纳米凝胶内体逃逸作用的示意图

为了验证这一假设，作者设计了含有(DS-NGs)和不含有(NonDS-NGs)二硫键的聚合物纳米凝胶(图2)，并评估了二者对于细胞摄取效率的影响。结果表明，与NonDS-NGs相比，EMT6细胞对DS-NGs的摄取增加了约4倍，这种差异可能源于DS-NFs中二硫键与细胞表面硫醇之间的相互作用。为了验证这一点，作者分别用埃尔曼试剂 (DTNB) 和碘乙酸钠封闭了细胞表面的硫醇后再次进行检测，发现DS-NGs的细胞摄取率分别降低了20%和50%，而NonDS-NGs无明显变化。说明两种纳米颗粒细胞摄取的差异性确实来源于二硫键。

图2. 含有/不含有二硫键的纳米凝胶示意图

尽管含二硫键的小分子和聚合物链已被证明是通过非内吞的方式进入细胞的，但对于体积更大的纳米颗粒而言，通过内体途径进入细胞的可能性更大。为了验证这一点，作者添加了不同摄取途径的抑制剂，发现蔗糖和NaN₃/2-脱氧-D-葡萄糖处理导致DS-NGs的细胞摄取被显著抑制，表明网格蛋白介导是其内化的主要途径。并且，DS-NGs在 4°C下的非显著摄取进一步证实了主要的内化模式是内吞作用，而不是直接摄取。另一方面，NonDS-NGs内化受到 EIPA、细胞松弛素D、dyngo和蔗糖的影响，表明摄取途径是组合的形式。为了进一步了解内化过程，作者将 DS-NGs与不同的荧光团 (AF488) 结合，并研究了与磺基-cy3 标记的 NonDS-NGs纳米凝胶同时进行的细胞内运输，结果表明两种纳米凝胶的内化途径具有共性。一旦摄取途径被确定为内体，作者进一步评估了两种纳米凝胶逃离内体的能力，通过共聚焦显微镜监测荧光标记的纳米凝胶与 LysoTracker GreenTM的共定位，以评估内体逃逸。如图 3a所示，DS-NGs表现出明显的内体逃逸，相反，NonDS-NGs几乎与LysoTracker Green共定位，表明被内体包埋。