基于疏水相互作用增强纳米孔道的单分子羟基化检测

羟基化作为一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰，对蛋白质的结构稳定性及功能调控至关重要。尤其是发生在脯氨酸上的羟基化，会显著改变其化学性质，进而影响细胞信号传导、代谢调控及疾病发生。然而，由于当前基于质谱的检测方法难以区分羟基化和氧化修饰，同时受到其低丰度及外源氧化干扰的限制，脯氨酸羟基化的精准鉴定仍面临巨大挑战。

近日，南京大学蒋杰副研究员、龙亿涛教授和上海师范大学邹爱华教授合作，通过在纳米孔道中引入疏水相互作用灵敏域，实现在复杂混合物中直接识别单个羟基化脯氨酸，并且不受周围氨基酸氧化状态的影响，为单分子水平的蛋白质羟基化检测提供了全新的解决方案。

纳米孔道技术作为一种高通量的单分子检测手段，已在单分子DNA测序、疾病标志物检测和蛋白质鉴定等领域取得重要进展。研究团队基于多年来对纳米孔道传感机制的深入理解，将其拓展到对蛋白质上单个翻译后修饰基团的识别，包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等。这些翻译后修饰通常体积较大，并伴随氨基酸残基电荷的变化。然而，目前纳米孔道技术对于在脯氨酸上引入小体积、电中性的羟基化修饰的识别仍存在巨大困难。

研究团队通过模拟天然羟基化脯氨酸结合蛋白的识别中心，创新性地在亲水性纳米孔道内腔中引入疏水相互作用增强域，利用羟基化修饰前后脯氨酸残基的亲疏水性反转，基于孔道内的弱相互作用变化以特异性响应多肽上的单个脯氨酸羟基化修饰。以缺氧诱导因子（HIF）蛋白质羟基化为例，该方法在无需纯化的条件下，实现了对不同HIF多肽片段上低丰度羟基化修饰的精准鉴定，即便在相邻氨基酸存在氧化修饰的情况下，仍能实现高特异性检测。