针对蛋白质羧基的新型共价选择性标记探针

分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，题目为“Selective Probing of Acidic Amino Acid Residues for Protein Structural Analysis by Covalent Labeling and Mass Spectrometry”，通讯作者是来自Texas大学的Saiful M. Chowdhury教授和Joseph A. Buonomo助理教授，研究方向为蛋白质的生物偶联策略等。

蛋白质的表面大部分由亲水性氨基酸所组成，这些氨基酸介导了蛋白质之间的相互作用，在这其中两种酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸扮演着重要的角色。此前传统的碳二亚胺的标记方法虽然能够激活羧基反应性，但受限于其非特异性和副产物的形成，并且会与多肽或蛋白上的其他亲核残基发生反应。因此寻找一种能够化学选择性修饰蛋白质表面酸性氨基酸残基的标记方法，对于研究蛋白质结构和复合物功能十分重要。本文开发出一种二苯基重氮甲烷DPDAM试剂，能够直接实现羧酸向酯键的转化并且不会生成其他副产物。

作为一种不可逆的标记反应，羧基直接进攻连接有偶氮基团的碳原子，形成共价键的同时，离去一分子氮气。在反应前后，反应体系将会发生颜色的变化。使用标肽优化反应条件的过程中，作者发现，当反应体系的pH值由4降到2时，不再标记两种酸性氨基酸，而仅对多肽的C端进行标记。这种pH值依赖的化学反应性被解释为在较为酸性的环境中，侧链上的酯键保护剂会因为更快发生的水解反应而脱除保护，从而形成仅对C端修饰的结果。通过DPDAM在不同pH条件下的化学反应性不同，能够实现对蛋白质酸性氨基酸侧链和C端的特异性标记，而不会对赖氨酸、组氨酸等发生脱靶标记。将该策略应用到纯BSA蛋白上的标记，能够成功鉴定出其表面上的酸性氨基酸残基。

作者以一组蛋白复合物作为实例证明了上述标记策略的可行性。Fel d 1蛋白是一种猫源的过敏原，作者进行了酸性羧基的标记，对其中一条标记肽进行检查，发现仅仅在蛋白质结构中暴露在表面的两个酸性残基被标记，而隐藏在内部的酸性残基并未被标记，这成功证明了在这些标记条件下，蛋白质的结构信息和互作信息能够得到保留，最终考虑到标记的低pH环境，作者认为这一策略在研究溶酶体中酸性氨基酸介导的蛋白互作上具有较大的优势。