吲哚醌类HAP-TAC缺氧条件下选择性降解靶蛋白

分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Indolequinone-Based Hypoxia-Activated Proteolysis Targeting Chimeras Selectively Degrade BRD4 in Hypoxic Cancer Cells”。通讯作者是来自University of Oxford和 University of California Los Angeles 的 Stuart J. Conway教授。他的研究兴趣聚焦于化学与生物学的交叉领域，致力于运用合成有机化学技术推动生物系统的深入研究。

目前蛋白降解与邻近诱导领域研究活跃，已有超过30种PROTACs进入临床试验，展现出巨大的治疗潜力。

然而该技术仍存在局限，尤其在临床转化阶段。首要问题是蛋白降解在健康组织中可能引发剂量限制性靶向毒性。此外，E3连接酶配体可能保留对其同源E3连接酶的基础活性而导致脱靶效应。例如基于沙利度胺及其类似物等免疫调节药物（IMiDs）的CRBN招募型PROTACs，仍能降解CRBN新底物IKZF1和IKZF3，这种脱靶活性会独立于POI降解过程抑制细胞增殖并刺激免疫系统。

为解决这些问题，研究者开发了能在特定环境下选择性激活的PROTACs前药。最早实现的是光激活PROTACs：通过在VHL或CRBN配体上连接光裂解基团实现空间控制释放，但治疗应用受限于紫外光的组织穿透能力。低氧激活前药（HAPs）是靶向肿瘤的有效策略。低氧是实体瘤标志性特征，由肿瘤快速生长导致代谢需求增加、血管结构异常及供血不足共同引发。利用这一机制，HAPs可以在常氧细胞中保持无活性前药状态，在低氧环境中经酶催化还原释放活性药物。

作者近期研究发现吲哚醌生物还原基团能在多种低氧条件下有效释放荧光染料。本研究利用该触发机制开发结构新颖的HAP-TACs：通过吲哚醌保护VHL或CRBN配体使其在常氧失活，在低氧环境中经NQO1或细胞色素P450氧化还原酶生物还原后高效释放活性PROTACs，实现环境依赖性蛋白降解。

先前研究表明， VHL配体（如VH032）中羟脯氨酸残基的结构对于高亲和力结合VHL至关重要。改变此位置立体构型或取代羟基会阻止与VHL的结合。因此，该官能团是连接生物还原基团以制备无活性前药的理想位点。在此位置连接的基团经生物还原和裂解后，将释放出有活性的PROTAC。

作者首先研究了在VH032的羟脯氨酸模拟物上连接硝基芳基生物还原基团（化合物1）。随后，作者使用人源CYP450还原酶，在低氧条件下按照既定方案处理4-硝基苄基保护的VH032 (1)。虽然观察到硝基被有效还原生成苯胺2，但该产物并未裂解生成自由的VH032配体3，这表明4-硝基苄基基团不适用于HAP-TACs的开发。接下来，作者研究了在Boc保护的VH032衍生物羟基上连接1-甲基-2-硝基咪唑基团的合成得到了化合物4，该基团在低氧下更易发生生物还原。用Zn(0)和NH₄Cl处理化合物4，随后用磷酸盐缓冲液处理，得到了Boc保护的VH032衍生物 (5)，这与还原及后续裂解过程一致。受此积极结果的推动，作者合成了MZ1 (8），然后将相同的基团应用到MZ1的VHL配体的羟基上，得到化合物6（NI-VHL）。

作者近期在生物还原性染料中应用了吲哚醌基团来成像低氧梯度，因此决定研究该基团是否也能用于制备低氧激活的PROTACs。得到了将吲哚醌直接连接到VHL配体上的化合物7（IQ-VHL）。为了给VHL招募型HAP-TACs提供阴性对照，还合成了在同一位置烷基化了无活性苄基的PROTAC (9, Bn-VHL)。

接下来，作者将化合物6和7、活性PROTACs MZ1 (8)、以及两个阴性对照 Bn-VHL (9) 与NADPH–CYP还原酶在低氧（<0.1% O₂）或常氧（21% O₂）下孵育24小时。同时在低氧无还原酶的条件下进行平行孵育，以评估化合物的水解稳定性。通过HPLC分析监测测试化合物的残余底物以及相应活性PROTACs的释放情况。虽然NI-VHL (6) 在低氧条件下24小时后释放了100%的MZ1，但它在常氧条件下也释放了82%的MZ1，这意味着该化合物在低氧与常氧之间释放MZ1的选择性不佳。此外，在没有酶的情况下，NI-VHL也释放了31%的MZ1，表明该化合物在所用缓冲条件下易发生水解而不稳定。相比之下，IQ-VHL (7) 在常氧条件下稳定，仅释放8%的MZ1；而在低氧条件下24小时后释放了41%的MZ1。该化合物在无酶的低氧对照孵育中也保持稳定，未观察到MZ1的释放。这些数据表明IQ-VHL (7) 能够在低氧条件下选择性释放活性PROTAC。

接下来，作者在A549细胞中评估了HAP-TACs在低氧（<0.1% O₂）或常氧（21% O₂）条件下诱导BRD4降解的能力。NI-VHL (6) 在常氧和低氧条件下的BRD4降解水平几乎无选择性。在1 μM浓度下，NI-VHL在常氧中诱导了94 ± 3%的BRD4降解，在低氧中降解了95 ± 6%的BRD4。而在更低浓度下，该化合物在两种条件下均未对BRD4水平产生显著影响。相比之下，IQ-VHL (7) 在常氧条件下几乎不诱导或仅诱导极少量BRD4降解，但在低氧条件下能实现BRD4的几乎完全降解。该化合物的最佳选择性出现在0.5 μM浓度：低氧条件下诱导98 ± 2%的BRD4降解，而常氧条件下仅观察到轻微降解。