重氮化合物（diazo compounds）是一类重要的中间体，被广泛应用于有机合成、药物研发、生物化学、高分子材料化学中。与叠氮相比，重氮基团具备改善的环加成反应动力学、可调的反应活性、丰富的电子，以及增加的HOMO能级等优势。

1993年，Badet课题组首次报道了基于N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）酯的重氮酰化试剂（1，图1a），该试剂后被用来修饰一些小分子和生物分子，包括牛血清白蛋白（bovineserum albumin，BSA）。2018年，Gaunt研究团队阐述了利用高价碘试剂（2，图1a）靶向甲硫氨酸残基，在多肽和蛋白质上安装亲电重氮基团的过程。

近期，英国剑桥大学Gonçalo J. L.Bernardes研究组在Bioconjugate Chemistry上发表了题为Precise installation ofdiazo-tagged side-chains on proteins to enable in vitro and in-cellsite-specific labeling的研究论文。文中开发了新的重氮羰基丙烯酸衍生物，该试剂可以快速地与蛋白质和抗体上的半胱氨酸残基发生化学选择性的硫醇加成反应，实现了在特定位点快速精确引入重氮基团的目标，为探索化学生物学中新的生物正交反应提供了可能（图1c）。

图1. 可在生物分子中引入重氮基团的选择性试剂。a. 已报道的用于多肽和蛋白质修饰的非特异性试剂1和2；b. 本文设计的重氮羰基丙烯酸试剂3；c. 重氮基团被引入目标生物分子后，可被多种活性探针标记。本文借助的是重氮与张力型炔烃的1,3-偶极环加成反应。

实验中，作者首先利用HWE（Horner-Wadsworth-Emmons）成烯反应合成了重氮羰基丙烯酸试剂（3，图1b）。室温下，将试剂3分别与N-Boc-Cys-OMe（6a，图2）和N-Cbz-Cys-OMe（6b，图2）反应，可生成重氮硫醚产物7a/7b，产率分别为90%和88%。同时，高效液相色谱层析（high performanceliquid chromatography，HPLC）分析发现，溶液中有还原型GSH时，重氮基团仍能稳定存在。另外，7b和10均可与张力型炔烃8发生环加成反应，得到吡唑类产物9和11（图2）。

 图2. 重氮羰基丙烯酸试剂对Cys的修饰。a. α,β-不饱和重氮酮3的合成；b. N-Boc-Cys-OMe6a和N-Cbz-Cys-OMe6b分别与化合物3反应10min，生成重氮硫醚产物7a和7b；c. 室温下，7b与还原型GSH在pH7.4 NaPi缓冲液中共孵育24h的稳定性；d、e. 7b和10与张力型炔烃8的环加成反应；f. 从原料10到产物11反应过程中HPLC图像变化。 

作者利用量子力学计算证实了张力型炔烃反应活性的增强（图3）。根据计算出的前沿分子轨道（FrontierMolecular Orbital，FMO）推测，重氮酮是缺电子试剂，可与线性或张力型炔烃发生逆电子需求（inverse-electrondemand，IED）的环加成反应。而由张力促进的环加成反应活性增强，主要基于张力型炔烃转变为过渡态构象所需能量较低。

图3. 量子力学计算获得的重氮化合物7’和10分别与张力型炔烃8’和12’发生1,3-偶极环加成反应的最低能量结构。

作者进一步探索了半胱氨酸特异性的重氮试剂与不同蛋白质间的生物偶联作用（图4）。首先，将试剂3分别与泛素蛋白Ub、突触结合蛋白Ⅰ（synaptotagmin-Ⅰ）的C2A结构域（C2Am）、膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）、人源白蛋白变体AlbuminⅤ0354共孵育。对比实验结果发现，蛋白质完全标记时所需试剂3的用量取决于Cys的反应活性、化学微环境和可得性（图4b-e）。同时，液相色谱串联质谱（liquidchromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对C2Am-3胰蛋白酶消化产物的分析结果表明，试剂3具有半胱氨酸选择性（图4f）。此外，利用圆二色谱（circular dichroism，CD）对Albumin和Albumin-3进行分析也发现，重氮基团的引入并不影响蛋白质的二级结构。这反映出，重氮试剂与蛋白质间生物偶联过程具有温和性和高效性（图4g）。

 图4. 试剂3与不同蛋白质中Cys的相互作用。a. 蛋白质中Cys与化合物3的反应图示；b-e. 不同蛋白质与3的偶合产物的ESI-MS结果。（b）ubiquitin-3；（c）C2Am-3；（d）annexin-3；（e）albumin-3；f.C2Am-3经胰蛋白酶消化后得到的多肽片段YPYCELGGK的LC-MS/MS结果；g. albumin和albumin-3的CD结果。 

紧接着，当重氮基团被引入目标生物分子后，可用高选择的张力促进型环加成反应加以验证（图5）。

图5. 蛋白质中重氮基团的鉴定。 a. 含重氮基团蛋白质与张力型炔烃8的环加成反应图示；b-e. 不同重氮蛋白与8反应产物的ESI-MS结果图。（b）ubiquitin-8；（c）C2Am-8；（d）annexin-8；（e）albumin-8。 

为探究重氮试剂3在修饰半胱氨酸标记抗体中的潜在应用，作者选取2Rb17c进行实验。2Rb17c是一种针对抗原HER2纳米抗体，带有一个半胱氨酸残基。作者首先用还原剂TCEP处理2Rb17c抗体以得到游离的Cys；接着，在室温下，将处理后的抗体与试剂3于pH8.0 NaPi缓冲液中反应，最终得到重氮纳米抗体2Rb17c-3（图6a、6b）。

图6. 点击反应助力重氮抗体的生成。a. 纳米抗体2Rb17c与化合物3反应生成重氮纳米抗体；b. 重氮纳米抗体2Rb17c-3的ESI-MS结果；c. 重氮纳米抗体2Rb17c-3与DBCO-Cy5 12发生1,3-偶极环加成反应；d. 荧光纳米抗体2Rb17c-12的ESI-MS结果图。

紧接着，作者利用细胞内点击反应表征了重氮基团在生物成像中{attr}2234{/attr}（图7）。实验中，将高表达HER2受体的SKBR3细胞预先在有或无重氮纳米抗体2Rb17c-3的溶液中孵育，再与DBCO-Cy5染料反应；洗脱多余的染料后，立刻对细胞进行共聚焦成像。经相同处理的低水平表达HER2的MCF-7细胞作为对照组。结果发现，预先用2Rb17c-3处理的SKBR3细胞荧光明显，而单独用染料处理或无HER2受体的细胞未检测到荧光。以上表明，重氮基团修饰的纳米抗体仍保留与HER2受体结合的能力，并且该基团可有效参与细胞内的点击反应。

图7. a. SKBR3细胞内，重氮纳米抗体2Rb17c-3用于生物成像的过程图示；b. SKBR3细胞先在有或无2Rb17c-3的溶液中孵育，再与DBCO-Cy5 12点击染料共孵育后的共聚焦荧光成像结果。

最后，作者评估了重氮化合物作为探针标记细胞裂解液中半胱氨酸的可行性，并探索了最优的标记条件。最终实验结果表明，重氮化合物可在HeLa细胞裂解液中与炔烃发生环加成反应。并且与铜催化反应相比，张力促进的环加成反应具有更好的蛋白标记效果（图8）。

图8. HeLa细胞裂解液中，3和13作为探针检测半胱氨酸。a、b. 2.5mM 重氮酮3（a）或2.5mM 重氮酯13（b）分别于不同浓度（5~100mM）的DBCO-biotin和alkyne-biotin共孵育后的SDS-PAGE（上）和western blot（下）结果；c、d. 不同浓度（5mM、10mM、50mM）的重氮酮3（c）或重氮酯13（d）分别于100mMDBCO-biotin和100mMalkyne-biotin共孵育后的SDS-PAGE（上）和western blot（下）结果。

综上，本文提出了一种在蛋白质和抗体特定位点快速且精确引入重氮基团的策略，这将有助于开发新的生物正交反应。

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.bioconjchem.0c00232